二甲苯诱导肾损伤的表观遗传机制研究

作     者：徐忠秀 

作者单位：南京大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦卫松;刘志红

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：二甲苯 大鼠 蛋白尿 肾小管 肾小球 肾小管上皮细胞 足细胞 凋亡 NGAL 细胞骨架 裂孔隔膜蛋白 甲基化 mRNA 

摘      要：研究一：二甲苯诱导大鼠肾损伤模型的建立目的：建立二甲苯诱导肾损伤的大鼠模型,观察吸入二甲苯对大鼠肾脏损伤的病理特点。方法：选择雄性SD大鼠,每日吸入二甲苯两次,每次3小时。分别收集吸入二甲苯4、6、8、10、12周各个时间点大鼠尿液、血清和肾组织,检测24小时尿蛋白、生化指标和尿NAG/肌酐;行肾组织光镜和电镜观察肾小管和肾小球病变,免疫荧光染色观察足细胞裂孔膜蛋白podocin和骨架蛋白synaptopodin表达和分布变化。-结果：(1)大鼠吸入二甲苯3周开始出现蛋白尿,8-9周尿中蛋白量达到最高(34.78士2.91mg/4h),此后蛋白尿维持在一个相对恒定的水平;(2)’实验大鼠尿NAG酶在吸入二甲苯2周后开始升高,第4周增高最为显著,并且达最高水平(25.03±4.88U/gScr)。(3)吸入二甲苯的大鼠总蛋白、白蛋白、肌酐和谷丙转氨酶与正常对照组相比没有显著差异,大鼠谷草转氨酶较正常对照组明显升高;吸入二甲苯12周,血清尿素氮与正常对照组相比增高。(4)光镜下观察可见肾小管上皮细胞空泡变性,肾小管细胞刷状缘脱落、扁平,部分小管上皮细胞崩解,脱落至管腔中。肾小球未见明显异常。超微结构观察可见多处肾小管上皮细胞刷状缘脱落,上皮细胞崩解,线粒体肿胀,基质电子密度降低,嵴移向周围,变短。足细胞节段足突融合,基底膜上皮侧可见中等密度的驼峰形成。(5)大鼠吸入二甲苯12周的肾组织免疫荧光染色,可见肾小球足细胞裂孔膜蛋白podocin和骨架蛋白synaptopodin荧光强度减弱,表达呈现不连续颗粒样分布。结论：成功建立了大鼠吸入二甲苯的肾损模型,初步证实吸入二甲苯能够导致肾脏损伤,大鼠出现蛋白尿,肾小管上皮细胞损伤明显,肾小球足细胞节段损伤,肾小管损伤程度明显重于肾小球。研究二：二甲苯诱导肾小管上皮细胞和足细胞损伤的体外研究目的：研究二甲苯诱导肾小管上皮细胞和足细胞损伤的特点,为阐明有机溶剂肾损害的机制提供参考。方法：采用不同浓度的二甲苯分别作用于体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)和人足细胞,ELISA法检测肾小管上皮细胞培养上清中NGAL和IL-18表达变化,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性;免疫荧光观察细胞足细胞骨架和重要膜蛋白表达的变化;用流式细胞技术检测肾小管上皮细胞和足细胞的凋亡。结果：(1)二甲苯诱导肾小管上皮细胞的损伤：随着加入二甲苯浓度的增加,肾小管上皮细胞凋亡比例明显增加,caspase-3活性增高,2mm浓度的二甲苯可导致98%的细胞凋亡。不同浓度二甲苯(0、1.O、1.4、1.8mm)作用HK-2细胞24h和48h后NGAL的分泌明显增加(p0.01),IL-18的表达没有明显改变。。(2)二甲苯诱导足细胞的损伤：不同浓度二甲苯刺激足细胞12h时细胞凋亡不显著,1.8mm的二甲苯刺激足细胞24h后可导致35.6%的细胞凋亡;刺激48h后凋亡的细胞明显增多,达81%。1.5mm二甲苯刺激48h后可观察到足细胞骨架丝状结构断裂,足细胞胞体回缩。随二甲苯刺激浓度升高,synaptopodin的表达逐渐减弱;podocin和nephrin的表达也明显减弱。结论：二甲苯在体外可以诱导肾小管上皮细胞和足细胞损伤,细胞凋亡增加,caspase-3活性增加,足细胞骨架结构损伤和裂孔隔膜蛋白的表达下降。研究三：二甲苯体外诱导肾小管上皮细胞和足细胞损伤的表观遗传机制研究目的：研究二甲苯体外诱导损伤的肾小管上皮细胞和足细胞DNA甲基化水平变化。方法：采用人甲基化450K芯片对细胞DNA的CG位点进行甲基化检测,定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测显著差异基因的mRNA表达水平,亚硫酸氢盐测序(BSP)及焦磷酸测序分别验证足细胞和肾小管上皮细胞芯片结果。结果：(1)二甲苯诱导足细胞损伤的甲基化芯片分析结果 与对照组相比,二甲苯刺激的足细胞有51条探针甲基化变化明显,其中25条探针显示为甲基化水平增加,26条探针显示为甲基化水平降低,共涉及到33个基因,从中挑选出6个甲基化增加较明显的基因(MY03B、IL-20、RPTOR、 DCL、HDAC4和P53)和2个甲基化降低明显的基因(SETBP和DEPTOR)进行qRT-PCR验证,验证发现在这8个基因中,IL-20的mRNA表达水平增高,P53的mRNA表达水平降低。BSP检测IL-20的6个CpG位点,有2个甲基化比例高于对照组,2个低于对照组,另外2个2组之间没有差异;P53 BSP检测的14个CpG位点,有4个甲基化比例高于对照组,8个低于对照组,另外2个位点无甲基化。(2)二甲苯诱导肾小管上皮细胞损伤的甲基化芯片分析结果 与对照组相比,二甲苯刺激的肾小管上皮细胞有243条探针甲基化出现显著差异,其中109条探针显示为甲基化水平增加