非PLC依赖PKC通路特异性甲状旁腺素模拟肽的建立及其对骨代谢作用的初步研究

作     者：郝松 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨德鸿

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：甲状旁腺素 信号转导通路 荧光能量共振转移 成骨细胞 基因芯片 成骨基因 

摘      要：背景：甲状旁腺素(PTH)是目前应用于临床的唯一促骨形成药物,它可以有效增加骨量,治疗骨质疏松及骨质疏松性骨折、关节假体松动及长期使用二磷酸盐引起的非典型骨折等。2002年美国FDA批准低剂量PTH间断性皮下注射用以治疗骨质疏松,2010年PTH被批准进入中国,治疗绝经后的重度骨质疏松。随着中国人口老龄化问题的日益严重,以及人们对于预防骨质疏松的意识尚浅薄等原因,骨质疏松症愈来愈成为困扰中老年人的疾病之一。骨质疏松症是一种以骨量减少及骨组织显微结构退化为特征,导致骨脆性增加及骨折危险性增加的一种全身代谢性骨病,目前骨质疏松症的治疗药物种类很多,其适用范围和作用机制也各不相同。国内的治疗主要以抗骨质吸收类药物为主,包括二膦酸盐类、降钙素、雌激素及选择性雌激素受体调节剂等,辅以促进骨矿化的钙剂、维生素D及其活性代谢物等,其对于骨质疏松症的治疗效果有限。PTH作为一种骨形成促进剂,研究证明其对骨密度提高的程度优于既往抗骨吸收类药物,对减少骨质疏松性骨折的作用也更为突出。但是,PTH在临床上的应用也受到诸多限制,如价格高,疗程长(2年),高剂量、持续应用会促进骨吸收(不能复合到内植入物以促进骨融合),可能存在致癌的风险,长期使用还存在疗效降低的可能性等,因此优化PTH,促进疗效,缩短使用时间,避免其副作用,是目前PTH领域研究的重要方向之一。人体中天然的PTH由84个氨基酸构成[PTH(1-84)],与Ⅰ型PTH受体(PTHR1)结合后激活PTHR1及其下游的多个信号途径,参与骨组织代谢的过程。主要的信号通路有：(1) Gs/cAMP/PKA信号转导通路,目前认为是PTH作用于骨组织的主要机制。(2) PLC/PKC通路。(3)非PLC依赖PKC激活途径(PTH/nonPLC/PKC)。(4) β-arrestin通路等。目前认为,PTHR1受体至少通过两种途径激活PKC,其一为激活质膜上的PLC,进而激活PKC;另一途径为不依赖PLC的PKC激活途径(nonPLC/PKC),即不激活PLC而通过其他分子介导机制激活PKC,具体信号特征并不清楚,其信号转导机制及调节骨代谢功能的研究是时下PTH研究领域的热点之一。PTH激活不同的信号通路与其自身的多肽结构密不可分,任何氨基酸的突变及构象的改变都有可能导致某些信号通路激活能力的缺失。研究证实,改变PTH的氨基酸序列能改变PTH的信号转导特征,如PTH(1-34)片段中,1-3位的氨基酸决定PTH的cAMP/PKA和PLC信号通路的激活功能;Ser1变成Gly1可使得PTH(1-34)失去激活PLC的能力;第19位氨基酸Glu19变成Arg19能够补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力减弱;Leu24,Leu28,va131突变成Glu后,PTH(5-34)不与受体结合Aib1,3,Nle8,21,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Arg19构成的组合突变亦称M突变,M突变可使PTH(1-34)的cAMP合成能力提高约40倍,PLC的激活能力提高66倍,与PTHR的结合力提高约10倍;在PTH(1-34)中,Ile5,Glul9,Val21等位点的突变严重干扰PTH(1-34)与受体的结合力：PTH(1-34)第1、3位氨基酸突变成氨基异丁酸(Aib)后促进与PTHR的结合和cAMP的形成。根据以上模拟肽结构的研究基础,我们拟通过氨基酸突变的方法来达到基本不影响PTH肽与受体结合能力,屏蔽cAMP/PKA和PLC激活能力的目的,设计nonPLC/PKC通路特异性PTH模拟肽的序列。我们的前期研究也表明,Gly1Arg19hPTH(1-28) (GR(1-28)和Gly1Arg19hPTH(1-34) (GR(1-34))均失去了激活PLC的能力,但GR(1-34)仍可激活PKC,而GR(1-28)却没有这样的作用,即PTH可以通过nonPLC/PKC通路激活PKC,且功能区域是PTH(29-34)片段。通过C57BL小鼠皮下注射观察发现,GR(1-34)显著增加骨量,尤其是受力的松质骨区域,显著强于GR(1-28)的作用,尽管后者具有与前者相同的cAMP激活特性,提示PTH作用下nonPLC/PKC通路的激活能够促进受力区松质骨合成,改善骨小梁微结构,促进新骨的形成。近期我们发现GR(1-34)具有比PTH(1-34)和GR(1-28)更强的促进脊柱融合的作用,具有一定通路选择性的PTH模拟肽具有较PTH更好的促骨形成作用和改善骨微结构的功能。但是nonPLC/PKC通路的具体信号介导分子仍不清楚,其对于骨代谢的作用机制仍需要深入研究。因此我们拟设计和筛选nonPLC/PKC信号通路选择性PTH模拟肽,并分析该通路特有的下游效应分子,进一步探讨PTH通过nonPLC/P