具有潜在治疗阿尔茨海默病作用的3种中药成分的药效学观察及其机制研究

作     者：周楠楠 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：梁平

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 中药成分 药效学 实验药理 

摘      要：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以记忆力减退、认知功能障碍为主要临床症状,以脑内β-淀粉样多肽（p-amyloid peptide, Ap）沉积形成的纤维斑块（即老年斑）,并伴有细胞内的神经纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）为主要病理改变。Aβ多肽有39-42个氨基酸,由β淀粉样前体蛋白（APP）经p-分泌酶和γ-分泌酶水解后产生的多肽。APP的裂解过程有二种途径：①非淀粉样途径：APP经α-分泌酶水解,产生非淀粉样可溶小分子蛋白sAPPa和CTFa （C端片段）,CTFa经γ-分泌酶裂解产生3KD的小分子P3和APP胞内区域的羧基末端（APP intracellular cytoplasmic domain, AICD）,该途径不形成Ap。②淀粉样途径： APP经p-分泌酶裂解,产生可溶性sAPPβ和CTFβ, CTFβ经γ-分泌酶裂解产生可聚集、具有神经毒性的Ap。研究表明,Ap聚集和沉积形成的纤维斑块可引发脑内氧化应激及炎症等反应,导致神经元的坏死和凋亡,最终可引起AD。目前国内外用于治疗AD的药物主要为化学合成类药物如胆碱酯酶抑制剂等,但其作用局限且治标不治本。中草药的应用布我国有着悠久的历史,其对一些慢性疾病有很好疗效且几乎无副作用等特点。近年来研究表明,中药成分天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷具有抗氧化、增加脑血流量、改善记忆力、神经保护等作用。但其是否对AD的治疗具有特异性及其具体作用的途径和相关机制尚不明确。为探讨以上问题,本课题主要研究内容为三种中药成分天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷对阿尔茨海默病模型小鼠的药效学作用,同时利用双转基因细胞模型研究其可能的作用途径及相关机制。本课题研究内容主要包括二个部分：1.三种中药成分在转基因模型鼠体内抑制Ap斑块的药效学作用;2.三种中药成分在体外抑制Ap的作用途径及其相关机制。第一部分：三种中药成分对AD转基因模型鼠体内的药效学作用的研究目的：研究3种中药成分（天麻素（GAS）、黄芪总皂苷（AST）、芍药苷（PAE））对AD转基因模型5XFAD鼠学习认知和记忆能力的影响和抑制脑内Aβ斑块的效果,并观察3种中药成分的干预是否对小鼠的生长发育有影响。方法：选用1.5月龄的APP/PS1双转基因模型小鼠,随机分为7组,另取同窝阴性小鼠作为正常对照,每组10只。 （1）阳性对照组（Tg）：转基因阳性小鼠给予不含药物的生理盐水;（2）阴性对照组（Control）:同窝阴性小鼠给予不含药物的生理盐水;（3）天麻素高剂量组（GAS-H）转基因阳性小鼠给予含300mg/kg/d天麻素的生理盐水（4）天麻素低剂量组（GAS-L）:转基因阳性小鼠给予含150mg/kg/d天麻素的生理盐水（5）黄芪总皂苷高剂量组（AST-H）:转基因阳性小鼠给予含160mg/kg/d黄芪总皂苷的生理盐水（6）黄芪总皂苷低剂量组（AST-L）:转基因阳性小鼠给予含80mg/kg/d黄芪总皂苷的生理盐水（7）芍药苷高剂量组（PAE-H）:转基因阳性小鼠给予含60mg/kg/d芍药苷的生理盐水（8）芍药苷低剂量组（PAE-L）:转基因阳性小鼠给予含30mg/kg/d芍药苷的生理盐水。每周测量各组小鼠体重及监测小鼠的日均饮水量,按照体重及日均饮水量调整给药剂量。给药4个月后,通过Morris水迷宫行为学实验检测小鼠学习记忆及认知能力的变化;免疫组织化学染色法观察脑组织内Aβ斑块的变化;ELISA法检测小鼠脑组织匀浆中Aβ含量的水平;另外为评价药物对小鼠的是否具有肝肾毒副作用,ELISA法检测小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐的变化及小鼠脑组织匀浆中IFN-γ和IL-4水平的变化。结果：1Morris水迷宫结果显示,与阳性对照组（Tg）组相比,用药各组小鼠平台寻找时间明显缩短,在原平台象限停留时间明显延长：第5天时,天麻素高剂量组（GAS-H）和低剂量组（GAS-L）平台寻找时间分别缩短83.66%和46.72%（P0.01）;,黄芪总皂苷高剂量组（AST-H）和低剂量组（AST-L）平台寻找时间分别缩短41.60%和23.78%（P0.01）;芍药苷高剂量组（PAE-H）和低剂量组（PAE-L）平台寻找时间分别缩短48.23%和29.31%（P0.01）;天麻素高剂量组（GAS-H）和低剂量组（GAS-L）在原目标象限停留时间分别延长2.28倍和1.83倍;黄芪总皂苷高剂量组（AST-H）和低剂量组（AST-L）在原目标象限停留时间分别延长1.88倍和1.38倍（P0.01）;芍药苷高剂量组（PAE-H）和低剂量组（PAE-L）在原目标象限停留时间分别延长1.83倍和1.62倍（P0.01）。2.免疫组化结果显示：5XFAD鼠的Tg组脑内海马和皮质区可见明显的大小不一、棕黄色的Ap斑块沉积,呈弥漫分布。GAS和AST及PAE各组与№组相比,脑内海马和皮质区Ap斑块呈散在分布,斑块体积和数目显著减少、染色变浅。Control组脑内未见Aβ斑块。IPP软件分析结果显示：与阳性对照组相比,3种中药成分均能够降低模型小鼠脑部海马区和皮层区Aβ斑块阳性面积。在海马区,天麻素高剂量组（GAS-H）阳性面积降低最为显著达70.13%;天麻素低剂量组（GAS-L）降低达39.25%（P0.01）;黄芪高剂量组（AST-H）和黄芪低剂量组（AST-L） Aβ斑块阳性面积分别降低62.39%和31.51%（P0.05）;芍药苷高剂量组（PAE-H）和芍药苷低剂量组（PAE-L） Aβ斑块阳性面积分别降低57.58%和30.52%（P0.05）。在皮层区,天麻素高剂量组（GAS-H）降低最为显著达80.96%;天麻素低剂量组（GAS-L）降低达36.67%;黄芪高剂量组（AST-H）和黄芪低剂量组（AST-L） Aβ斑块阳性面积分别降低69.57%和37.90%（P0.01）;芍药苷高剂量组（PAE-H）和芍药苷低剂量组（PAE-L） Aβ斑块阳性面积分别降低66.62%不口27.62%（P0.05）。3. ELISA检测小鼠脑匀浆中Aβ含量的结果显示,与Tg组脑匀浆Aβ的平均OD值相比,AST、GAS和PAE各组均有不同程度降低。其中,天麻素高剂量组（GAS-H）降低效果最为显著达62.18%;天麻素低剂量组（GAS-L）降低达35.94%;黄芪高剂量组（AST-H）和黄芪低剂量组（AST-L）小鼠脑匀浆中Aβ分别降低51.58%和24.07%（P0.01）;芍药苷高剂量组（PAE-H）和芍药苷低剂量组（PAE-L）小鼠脑匀浆中Aβ分别降低51.02%和14.16%（P0.05）。4. ELISA法检测小鼠脑组织匀浆中细胞因子水平的变化的结果显示,用药各组小鼠（天麻组小鼠、黄芪总皂苷组小鼠及芍药苷组小鼠）与阳性对照组小鼠相比,其脑组织匀浆中IFN-γ和IL-4的含量均无明显变化（P0.05）。5. ELISA法检测小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐的结果显示,用药各组小鼠（天麻组小鼠、黄芪总皂苷组小鼠及芍药苷小鼠）与阳性对照组小鼠相比,其血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐的含量均无明显变化（P0.05）。6.测量各组小鼠的体重变化的结果显示,在不同的时间点（1,2,3,4月）,阴性对照小鼠,阳性对照小鼠及用药各组小鼠的体重无明显变化（P0.05）。第二部分：三种中药成分抑制模型细胞中Ap的作用途径及相关机制的研究目的：利用双基因转染细胞模型117细胞（过表达Ap和p-分泌酶）和146细胞（过表达Ap和γ-分泌酶）,研究三种中药成分天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷抑制Ap的作用机制。方法：天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷以不同的浓度（10、25、50、100μmol·L-1）作用于117模型细胞和146细胞,ELISA双抗夹心法分别检测细胞内外Ap含量变化,Q-PCR法检测117细胞BACE mRNA和146细胞PS1 mRNA转录水平,Wsetern-blot法检测p-分泌酶和γ-分泌酶蛋白水平的变化。同时,CCK-8试剂盒检测三种中药成分对细胞活力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果：1. ELISA法检测结果显示,与未干预对照组相比,三种中药成分天麻素、黄芪总皂苷、芍药苷对117细胞模型和146细胞模型内外Aβ水平均有降低,且降低效果呈药物浓度依赖性。天麻素、黄芪总皂苷、芍药苷抑制117细胞内Ap最高分别达69.2%、64.8%和47.9%（P0.01）,抑制117细胞外Ap最高分别达65.8%、67.8%和25.2%（P0.05）;天麻素、黄芪总皂苷、芍药苷抑制146细胞内Aβ最高分别达67.9%、82.6%和49.9%（P0.01）,天麻素、黄芪总皂苷、芍药苷抑制146细胞外Aβ最高分别达67.1%、65.4%和50.9%（P0.01）。2. Q-PCR检测实验结果显示,天麻素对117细胞p-分泌酶转录水平有降低作用。与天麻素未干预对照组相比,经天麻素处理24 h的117细胞,BACE mRNA转录水平降低,且降低效果呈浓度依赖性。其中,25μmol·L-1天麻素剂量组降低22.8%,50和100μmol·L-1天麻素剂量组分别降低30.7%和32.9%（P0.01）。未观察到芍药苷、黄芪总皂苷对117细胞BACE mRNA转录水平有影响;天麻素、黄芪总皂苷、芍药苷三种中药成分对146细胞内γ-分泌酶转录水平均无影响。3. Western Blotting检测实验结果显示,天麻素在25、50、100μmol·L-1浓度均可降低β-分泌酶蛋白的表达,且在50μmol·L-1时降低最明显为47.9%（P0.01）。黄芪总皂苷、芍药苷均对β-分泌酶蛋白的表达无影响。天麻素、黄芪总皂苷、芍药苷均对γ-分泌酶蛋白表达均无影响。4.CCK-8法测定结果均显示,天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷各自干预117细胞和146细胞24h后,各药物干预组细胞活性相对于未干预对照组无明显变化;且流式细胞术检测结果显示,天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷干预117细胞24h后,各干预组的凋亡率与未干预组相比,未有差异变化。总结：长期以来对中药治疗AD是否具有特异性或特效性,如有特异性其作用途径和作用机制是什么,一直都不清楚。本课题在这方面做了探索研究,初步结果显示天麻素、黄芪总皂苷和芍药苷对AD的治疗均具有特异性,其作用途径是通过抑制Ap产生并减少Ap斑块形成,进而减少老年斑对神经细胞的毒性作用,抑制AD的病程发展。其中天麻素的作用最显著,其作用机制可能与抑制β-分泌酶的表达有关。