微流控免疫芯片在病原菌快速检测中的研究

作     者：管潇 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张惠静

授予年度：2009年

学科分类：080903[工学-微电子学与固体电子学] 0809[工学-电子科学与技术（可授工学、理学学位）] 08[工学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：病原菌 E. coli O157∶H7 快速检测 微流控芯片 免疫分选 微珠 ATP-生物发光 

摘      要：病原菌的常规检测包括非选择性和选择性培养、生化反应和血清学鉴定等步骤,其操作繁琐,周期长(5-7d),费时费力,不能满足当代社会对环境、食品安全监督和传染性疾病快速诊断的需要。近年来,随着生物技术的发展而建立起来的快速检测技术(如免疫分析技术、PCR技术等)虽然能够在较短时间内鉴定病原菌,但仍存在如灵敏度较低、假阳性和假阴性率高、操作复杂、成本昂贵等缺陷,因此发展能够准确、敏感、快速地检测病原菌的技术方法刻不容缓。 微流控芯片作为新出现的微分析技术平台,以其结构缩微化、功能集成化、样品和试剂耗量低、高通量输出、分析时间短、易于便携和自动化等优势,近年来在微生物检测中的发展非常迅速。但现有的微流控芯片微生物检测的研究主要是针对微生物研究中的某一单元或步骤,如富集/分选、预处理或分离检测展开的,缺乏集样品处理、稀少样本富集/分选和检测于一体的整合技术或方法,整个研究也处于起步阶段。而如何将病原菌检测各个环节的操作过程集成于一张微流控芯片上,并形成自动化的病原菌检测系统,是当今微流控芯片用于病原菌检测所面临的挑战。 鉴于当今社会对病原菌快速检测的要求和现有检测技术的缺陷,本研究构建了一个微流控免疫分析芯片,在芯片上开展了病原菌的分选/富集和生物发光检测研究。微流控芯片免疫分选技术具有抗体和试剂耗量低、反应速度快、易于集成和实现自动化的优势;而以具有纳米至微米级尺寸粒径的微珠作为抗体的固相载体,不但可以增大抗原-抗体反应的比表面积,而且其易于填充和更换的特点可以使芯片各单元功能更加分明,另外芯片构型简单、价格低廉,易于构建和普及。利用ATP-萤火虫荧光素-虫荧光素酶体系的生物发光分析对微生物进行定量,可因光子产生率高而达到极高的灵敏度,不需光源和复杂的光路,也无需对微生物进行标记,即可得到微生物数量和活性的信息,是可集成于微流控芯片上的理想检测方法。 因此,本研究以*** O157∶H7为检测目标,将针对该细菌的高特异性和高捕获率的免疫微珠富集腔设计于芯片微通道中,并采用ATP生物发光体系对富集到的细菌进行在线定量分析,建立了集高特异性捕获/富集和高灵敏度检测为一体的病原菌快速检测法。 研究首先根据实验目的,设计PDMS/玻璃微流控芯片的微通道构型和尺寸,芯片包括流体传输、免疫捕获和发光检测三个功能性区域。通过模塑法完成了芯片的制作,并对制作工艺和封接方式进行了优化。 其次,通过对粒径为50μm的玻璃微珠表面进行硅烷化处理和抗*** O157∶H7多克隆抗体的共价连接,完成了玻璃微珠的生物功能化修饰。将玻璃微珠填充于芯片微通道的六边形腔内,通过探索微珠传输流速和方式,构建了一个呈单层均匀排列的芯片免疫微珠富集腔。并在荧光显微镜下观察经吖啶橙染色的*** O157∶H7在芯片内的捕获,进而验证了免疫富集腔能够有效捕获/富集到细菌。利用平板培养计数法评价了芯片免疫富集腔的捕获效率,通过对芯片进样和冲洗的参数的优化,使填充有免疫玻璃微珠的免疫富集腔对细菌样品的实际捕获率达到91.75%～95.62%。 最后,通过ATP-萤火虫荧光素-虫荧光素酶体系和微弱发光检测仪实现了对芯片内捕获到的细菌的生物发光检测,并对芯片内发光反应的各种条件进行了优化。通过细菌浓度—发光强度回归方程的拟合,建立了用生物发光反应的发光强度对细菌进行定量的方法。对方法的线性范围、可靠性、重现性、稳定性和特异性进行评价,证明了该微流控芯片病原菌检测系统特异性高,并能对猪肉样品中的*** O157∶H7进行准确定量。 综上所述,本研究建立了一个特异性好、准确度高的微流控芯片病原菌快速检测方法,并且该方法可将整个病原菌检测过程控制在20min以内,为进一步开展病原菌的现场快速检测系统的研制奠定了坚实的基础。