甲泼尼龙琥珀酸钠对肾上腺素致大鼠神经源性肺水肿肺组织中的AQP5表达的影响

作     者：陈玲 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙素真

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：神经源性肺水肿 肾上腺素 水通道蛋白-5 甲泼尼龙琥珀酸钠 大鼠 

摘      要：神经源性肺水肿(Neurogenic Pulmonary Edema, NPE)是中枢神经系统(CNS)疾病的严重并发症之一。是指无原发性心、肺、肾等疾病,由中枢神经系统疾病(如颅脑损伤等)引起的突发性的颅内压增高而导致的肺水肿,也称中枢性肺水肿。近年来,常由发病率显著升高的重症手足口病(EV71感染)导致,使过多的液体蓄于肺间质或肺泡内,形成间质性或肺泡性肺水肿。重症手足口病所致神经源性肺水肿的临床表现为呼吸困难、呼吸窘迫、咳粉红色泡沫痰、咯血、呼吸循环衰竭等急性症状,其发病急,病情较凶险,进展迅猛,治疗困难、死亡率高(90%)1]。在医学界,对NPE发病机制的研究一直是比较活跃的一个领域,尽管有许多学者对此已经做了大量的研究工作,但神经源性肺水肿的确切机理至今仍不十分清楚。在其病理改变中，肺部通透性增加是一个特征性的表现。 AQP5广泛分布于肺泡Ⅰ型上皮细胞的腔顶面,还位于鼻咽和呼吸道黏膜下腺上皮细胞腔顶面及气道上皮细胞腔膜面，AQP5在肺组织中表达最多。是肺组织水转运功能中液体快速转运的通道,对维持肺组织的正常生理功能、肺水转运中起到不可低估的作用。甲泼尼龙琥珀酸钠是人工合成的糖皮质激素，在治疗手足口病中，是一种常用的物，药作用时间属中效类，具有强大的抗炎作用,可以改善神经传导功能,减轻炎症和水肿[2]，减少儿茶酚胺的缩血管功能和血栓的形成3]，能降低毛细血管通透性，减轻肺水肿，同时有效防治脑水肿，阻断肺水肿-脑水肿的恶性循环。本实验通过观察不同剂量的甲强龙(甲泼尼龙琥珀酸钠)对肾上腺素诱导的神经源性肺水肿大鼠肺组织AQP5的表达、病理形态学、湿干重比值等的影响，探讨其对神经源性肺水肿的保护作用，为其临床应用提供理论依据。 目的： 观察不同剂量的甲泼尼龙琥珀酸钠对肾上腺素诱导的神经源性肺水肿大鼠肺组织AQP5的表达、病理形态学、湿干重比值等的影响，探讨其对神经源性肺水肿是否具有保护性作用差异。 方法： 1动物模型的制备 Wistar大鼠雌雄不拘，1月龄，体重100±8g,腹腔注射肾上腺素造模型，神经源性肺水肿组大鼠按2.7mg／kg给予腹腔注射肾上腺素注射液(1mg:1ml)，观察20min左右，大多数大鼠腹腔注射后约5min左右出现呼吸频率加快、弓背,15min可见呼吸困难，若存活时间大于20min者,则造模成功。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠卧位置于操作台上，去毛。取上腹正中切口，打开胸腔，结扎气管，取出双肺。 2动物分组 将Wistar大鼠50只，随机分为正常对照组(n=10)、神经源性肺水肿组(NPE组，n=10)、甲强龙治疗组(n=30)，后又以不同剂量分为三个亚组，每个亚组10只大鼠。其中甲强龙治疗组于造模后立即腹腔注射。 3肺形态观察 麻醉大鼠后，迅速开胸，暴露气管，用线扎住气管下端把肺完整地取下,观察肺的颜色和形态。 4肺湿干重比检测 用吸水纸吸干大鼠右肺中叶表面水分和血液，电子天平称湿重。将右肺中叶置于65℃烘箱内72h至恒重，再称干重，计算右肺中叶湿/干重比值(W/D)。 5病理形态学观察 分别取左肺放入4%甲醛中固定，4℃存放至肺组织沉到瓶底，之后脱水、透明、包埋、石蜡切片，然后进行HE染色，观察肺组织病理学改变。 6肺组织AQP5免疫组化染色 采用链霉素-亲合素-生物素过氧化物酶法(SABC)。切片经常规脱蜡、水化后,用3%过氧化氢去除内源性氧化酶,微波抗原修复,余步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。AQP5抗体稀释浓度为1：400。光镜下出现细胞胞质呈棕黄色着染者为阳性表达细胞。每张切片随机选择10个视野(200×)测定其吸光度值(absorbance，A)，计算平均A值反映其表达强弱。 7实时定量PCR方法检测AQP5mRNA表达 取右肺上叶组织，采用TRIzol试剂(购自invitrogen公司)参照说明书提取各组大鼠的肺细胞总RNA,再逆转录成cDNA,以适量cDNA为模板。将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件相同。AQP5引物(由invitrogen公司合成),引物序列：GAPDHβ-actin：上游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;下游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’;(244bp),AQP5上游引物5’-GTGACAGACAAGCCAATGGATAA-3’;下游引物5’-GCCCTCTTAATAGGAAACCAGAT-3’(287bp)。 8AQP5Western blot 取右肺下叶组织500mg加上1ml提取液用玻璃匀浆器匀浆后提取，4℃,12000r/min,离心5min,取上清液，然后加入等体积的2χSDS上样缓冲液，在100