慢性粒细胞白血病cyclin D2 的表达研究

作     者：宋俊敏 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐世荣

授予年度：2002年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：细胞周期素D2 慢性粒细胞白血病 p210BCR/AB 酪氨酸激酶胞内抗体 流式细胞术 

摘      要：目的：细胞周期素D2(cyclin D2)是人类G1期细胞周期蛋白cyclin D家族的一个重要成员，与正常细胞周期进展中G1／S检测调控点的功能密切相关。cyclin D2的表达与成人T淋巴细胞白血病病毒(HTLVⅠ)原癌基因产物Tax以及与各型B淋巴细胞白血病、成人生殖细胞肿瘤的相关性已被证实。慢性粒细胞白血病是一种原发于造血干祖细胞的恶性克隆性疾病。其中，BCR／ABL融合基因产物蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性异常增高，导致底物信号分子磷酸化，在BCR／ABL恶性转化过程中起着极为重要的作用。本研究是建立在赵春华教授在国际上首次建立的表达b3a2 BCR／ABL cDNA的人慢性粒细胞白血病原代造血干祖细胞模型以及表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内单克隆抗体MSCV-ib-IRES-eGFP逆转录病毒载体的工作基础上。我们进一步将此逆转录病毒载体转导人BCR／ABL+的K562慢性髓系白血病细胞系，建立了表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶胞内单克隆抗体的K562-ib-eGFP体外细胞模型，并以这两种模型为基础研究了cyclin D2在慢性粒细胞白血病中的表达及其与BCR／ABL融合基因产物蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性之间的关系。 方法：以半定量逆转录-聚合酶链(RT-PCR)法检测cyclin D2 mRNA在人慢性粒细胞白血病原代造血干祖细 中文摘要 胞模型以及对照模型中的表达。以碱裂解法大量扩增表达 抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内单克隆抗体的逆转录病毒 载 体MSCV－fo－IRES七GFP 以 及 对 照 载 体 MSCV－IRES七GFP。采用聚己二醇沉淀法纯化提取的质 粒。采用 PCL－AmphO质粒快速转染系统，共转染 293hi 包装细胞系，将获得的病毒上清转导K562细胞系，建立 了表达抗ABL 蛋白酪氨酸激酶胞内单克隆抗体的 K562－fo七GFP细胞模型。同时，采取同样方法建立对照模 型K562七GFP。通过合成胞内抗体特异性引物，以PCR 的方法，检测胞内抗ABL蛋白单克隆抗体的表达。以免 疫印迹法检狈K562，K562－ibeGFP及K562－eGFP细胞 中BCR朋L及C－ABL蛋白的表达，以PTK特异性底物 l;***法检测抗体模型中BCRABL及0ABL蛋白酪氨 酸激酶活性的变化。以半定量逆转录－聚合酶链（RTPCR） 法检狈K562细胞、K562－ibeGFP细胞、K562－eGFP细胞 以及 15例 CML患者骨髓细胞、12例正常人骨髓标本中 cyclin DZ IlllLrvA的表达。以免疫印迹法检测 K562细胞。 K562一七GFP细胞、K562《GFP细胞 cyclin DZ蛋白质表 达。以流式细胞术间接免疫荧光标记法检测上述标本 cyclin DZ蛋白质水平的变化。应用FACS calibur流式细 胞仪，cellquest软件，分析K562细胞、K562－ibeGFP细 胞以及K562《GFP细胞周期分布以及 cyclin DZ细胞周期 时相性表达。 结果：以RT干CR法，在人CML原代造血于祖细 胞模型中能检测到 cyclin DZ基因的表达，在转染空载体 MSCV七GFP 的脐血CD34＋七GFP 细胞以及脐血 2 中文摘要 CD34七GFP细胞中，末能检测到 cyclin DZ基因表达。 在表达抗ABL 蛋自酪氨酸激酶胞内抗体的 ***七GFP细胞模型中，用PCR的方法，能够检测 到胞内单克隆抗体的表达。通过免疫印迹法检测 KS 62－fo七GFP抗体模型中BCRABL及c－ABL蛋白的表 达，我们发现，表达抗人ABL酪氨酸激酶区胞内单克隆 抗体的K562－ibeGFP细胞与K562细胞以及K562干GFP 细胞相比，其 pZIO队…‘及 ABL蛋白的