大鼠咬合创伤早期牙槽骨细胞间通讯的基因芯片研究

作     者：商思霞 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐欣;孙惠强

授予年度：2012年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：咬合创伤 骨改建 基因芯片 细胞间通讯 缝隙连接 

摘      要：背景和目的 咬合创伤是指个别牙所受的咬合力大小超过其牙周组织的耐受力,造成牙周组织损伤的情况,在口腔科就诊的患者中广泛存在。牙槽骨是体内具有高度可塑性的一种骨组织,成为研究骨信号通路时的首选体内骨。咬合创伤机制的研究前提是能够有效地建立咬合创伤动物模型,咬合面粘结复合树脂升高咬合是一种损伤小、效果肯定的方法。MMP-9是一种糖化蛋白酶,已有研究证实其在骨吸收过程中由破骨细胞分泌产生,可以用来检测骨吸收的进程。 细胞间通讯在骨改建的过程中起到十分重要的作用,它使得骨细胞、成骨细胞、破骨细胞之间的信息能够高度精确和高效地传递到效应细胞上与相应的受体相互作用,发生一系列变化。细胞间通讯有直接接触型、直接联系型和间接联系型三种方式。基因芯片技术可以准确、灵敏的检测、分析杂交信号,当前广泛应用于生物医学、基因组学研究等领域。本实验采用的大鼠Roche-Nimble Gen全基因组表达谱芯片具有高密度、高通量等特点,能够同步分析26419个基因的表达状况。 鉴于目前咬合创伤早期细胞间通讯的表达状况的相关文献报道较少,骨改建中细胞间通讯的具体机制尚不清楚,本实验采用复合树脂粘结方丝法建立大鼠咬合创伤模型后,利用MMP-9检测其牙槽骨内骨吸收进程;并对咬合创伤24小时的大鼠牙槽骨内的细胞间通讯利用全基因组表达谱芯片进行分析,以期为进一步阐明骨改建信号通路分子机制、临床预防和治疗骨疾病提供一定的实验依据。 材料和方法 1.大鼠咬合创伤模型的建立及牙槽骨中MMP-9的表达 在大鼠右侧上颌第一磨牙（?）面使用复合树脂粘结方丝,抬高咬合1mm,以形成右侧下颌第一磨牙的咬合创伤。截取右侧下颌磨牙区牙槽骨,制作脱钙骨组织切片,采用免疫组织化学的方法观察咬合创伤1天、3天、7天、14天时,MMP-9在大鼠第一磨牙根周区牙槽骨内的表达情况。 2.大鼠咬合创伤早期牙槽骨细胞间通讯状况研究 在大鼠咬合创伤24小时后,截取其以第一磨牙近远中径为界的下颌骨组织,Trizol法提取总RNA,反转录为cDNA并使用探针标记,进行基因芯片的杂交,对结果进行Pathway和GO分析,并选取三个差异显著因子进行RT-PCR验证芯片结果的可靠性。 结果 1.大鼠咬合创伤模型的建立及牙槽骨中MMP-9的表达 形态学观测显示咬合创伤14天时出现明显的形态学改变：X线根尖片中根尖区牙周膜增宽;HE染色见破骨细胞及骨陷窝的形成。免疫组织化学检测结果显示：咬合升高3天时大鼠根周牙槽骨中MMP-9阳性染色细胞明显增多,且与对照组比有统计学差异（P0.05）,随着咬合创伤时间延长,阳性细胞的百分比逐渐增大。 2.大鼠咬合创伤早期牙槽骨细胞间通讯状况研究 基因芯片杂交结果显示咬合创伤24h时,实验侧与对照侧相比出现显著表达差异的基因有586个,涉及106个不同的骨信号通路。其中与细胞间通讯相关的通路涉及到细胞间粘附分子、粘着连接、缝隙连接、焦点粘连以及紧密连接通路 等。各通路中的主要因子明显下调,细胞间通讯普遍受到抑制。 结论 1)咬合面复合树脂粘结方丝升高咬合1mm的方法建立的咬合创伤大鼠动物模型能够引起骨改建,是确实有效的;咬合创伤后24小时研究骨改建早期信号通路状况是可行的。 2)在咬合创伤24h时,骨相关信号通路中的细胞间粘附分子、粘着连接、缝隙连接、焦点粘连以及紧密连接等细胞间信息传递通路普遍受到抑制。