灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠血脑屏障通透性的影响

作     者：卢晓梅 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张海鹏

授予年度：2004年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：灯盏花素 脑缺血再灌注 血脑屏障 明胶酶 抗氧化酶类 伊文思蓝 脑皮质血流 

摘      要：目的 血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是由内皮细胞的紧密连接，基膜及星形胶质细胞组成的一个位于脑和微血管之间的物质调节界面，对进出的物质具有选择性通过作用。血脑屏障破坏是脑缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)脑损伤的重要的病理生理基础。炎症和免疫反应包括白细胞浸润，巨噬细胞激活等产生大量的蛋白水解酶，氧自由基和其他效应分子，导致脑毛细血管内皮细胞及其基底膜损害，破坏BBB的完整性，导致BBB的通透性增加。灯盏花素(Erigeron Breviscapus，EB)是从菊科短亭飞蓬属植物灯盏花(Erigeron Breviscapus(Vant.)Hand-Mazz)中提取的活性有效成分，主要为灯盏乙素(4,5,6三羟基甲酮-7-葡萄糖醛酸苷，4,5,6-3 hydroxy methanone-7-glucose aldehyde acid anhydride)，具有抗凝和抗血栓形成，改善血液流变学，改善微循环障碍，增加脑血流量及抗自由基等作用。临床上广泛应用于脑血管病的治疗。灯盏花素治疗脑缺血再灌注损伤文献已有报道，但机理还知之甚少。本实验从血脑屏障角度探讨了脑缺血后再灌注的损伤情况，从而阐明灯盏花素的作用机理。 方法 1、动物模型的制作：采用清醒小鼠颈部手术仔细分离双侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断双侧颈总动脉血流10min，松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注，然后无菌缝合颈部皮肤。假手术组只分离出颈总动脉，不阻断血流。灯盏花素治疗组于术前15min各腹腔注射灯盏花素注射液10mg／kg，其余两组同时腹腔注射等量生理盐水。 2、脑皮质血流的测定：小鼠腹腔麻醉，固定，PF-3型激光多普勒血流仪于正常时、缺血10分钟、再灌注10分钟、再灌注4小时、12小时、24小时、48小时、72小时分别测定脑皮质血流。 3、脑组织伊文思蓝测定：在处死动物前1h经尾静脉注入2％伊文思蓝(1mL／kg)，至尾部，四肢，粘膜均变为蓝色，在摘取脑组织前20min经在体 心脏灌注生理盐水至流出清亮的液体为准。取脑组织用电子天平精确称重 后，投人中号试管中，加人3rnL甲酞胺制成匀浆，加盖后轻轻摇匀于45℃水 浴箱孵育48h后，3000r/而n离心15]rnin，取上清液在721分光光度计比色 (入=632nm)。 4、明胶酶谱法明胶酶活力测定:取海马区的脑组织经匀浆离心制成蛋 白质抽提液，取20过上样于含sm扩r吐明胶的聚丙烯酞胺凝胶中，20诚恒 流电泳，电泳后，将凝胶于2.5%的Triton一Xloo液内振荡37℃，1小时，酶 缓冲液内孵育37℃，42小时。孵育结束后经染色液染色3小时，及脱色液 分别脱色0.5、1、2小时，显示出MMP一2和MMP一9位于蓝色背景上的透 亮带。 5、自由基及其清除系统活力或含量的测定:于再灌注72小时处死小 鼠，于冰盘上取海马区的脑组织，置匀浆管中，加人预冷的生理盐水若干毫 升，用匀浆器制成10%的匀浆，用台式高速离心机以10000r/min离心smin 取上清液。用NOS、GSH一Px、SOD、CAT、丙二醛测试盒分别在入二530run、 入二412nln、入二55Onm、入二405llln及入二532nm处检测酶活性及丙二醛的含 正三刁_ 鉴巨。 结果 1、脑缺血再灌注小鼠不同时间脑皮质血流的变化情况 脑皮质血流于缺血10min达到缺血前脑皮质血流的22.3%，再灌注 10min脑皮质血流明显增加，证明脑缺血再灌注模型建立成功，再灌注4h 有所降低，12h、24h又有增加，48小时后与正常差异不显著。 2、灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠脑组织中伊文思蓝含量的影响 脑缺血再灌注后从4h起脑组织伊文思蓝渗出逐渐增多，48h达高峰， 以后有下降趋势。灯盏花素治疗组伊文思蓝渗出明显低于相应时间的脑缺 血再灌注组(P0.05)。 3、灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠脑组织中明胶酶，MDA含量及NOS、 esH一P、、soD、CAT活性的影响 明胶酶(A，B)于脑缺血再灌注后4小时开始出现，MMP一9(明胶酶 B)于48h达到高峰，MMP一2(明胶酶A)于48h开始增加，48小时、72小时 变化不明显。从图象分析表明，灯盏花素治疗组明胶酶B的积分值于48小 时、72小时明显低于脑缺血再灌注组，明胶酶A表达变化不明显。脑缺血 再灌注组MDA含量明显高于假手术组(P0.05)，GSH一Px、SOD、CAT酶 活性明显低于假手术组(P0.05)，NOS活性明显高于假手术组(P0. 05)。灯盏花素治疗组MDA含量显著低于脑缺血再灌注组(P0.05)， GsH一Px、SOD、CAT酶活性