肾内源性干细胞在急性肾小管坏死修复中的作用

作     者：单娟萍 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：叶有新

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：急性肾小管坏死 肾内源性干细胞 

摘      要：[研究背景及目的] 急性肾小管坏死(Acute Tubular Necrosis, ATN)是急性肾功能衰竭最常见的类型,约占75%-80%。由于对受损肾小管的修复过程了解甚少,急性肾衰竭尚缺乏有效的治疗方法,只能依靠透析维持、被动地等待其自行恢复,因而死亡率仍然高达50%-80%。近年研究发现,干细胞参与了ATN的修复过程,但对干细胞的来源尚未明了。本实验建立大鼠缺血再灌注ATN模型,通过观察BrdU阳性细胞在正常和ATN鼠肾脏的分布情况,并对这些阳性细胞分别采用Pax2、Vimentin和activaed caspase-3进行双重染色,探讨参与ATN修复过程的干细胞的来源。 [材料与方法] 1大鼠肾脏组织的收获 体重220g左右的6周龄雌性SD大鼠左肾动脉夹闭60min后再灌注(假手术对照组不夹闭左肾动脉),制作SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型(I／R)用BrdU标记,术后第1、3、5、7、14、21、28、56天处死大鼠,收集血样和肾脏标本。 2 Scr、BUN测定经心脏穿刺留取的大鼠血液2ml,静置30min,3000r／min离心30min后收集血清,Beckman自动生化仪测定BUN,Scr值 3石蜡包埋及石蜡切片肾脏组织经过10%福尔马林固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋。石蜡切片成4μm组织切片,烤片60℃2h。 4 HE染色 石蜡切片经过二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,苏木素-伊红染色,再梯度酒精及二甲苯脱水,封片。镜检 5免疫组化EnVision法 石蜡切片常规脱蜡至水。依次消除内源性过氧化物酶活性,抗原修复,组织背景封闭,滴加特异性抗体,酶标记用ChemMateTM nVision+/HRP作用切片,DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明后封片,镜检。 6免疫荧光双标法 石蜡切片常规脱蜡至水。抗原修复,组织背景封闭,滴加特异性抗体1。IgG-FITC标记的荧光二抗作用。切片预处理。胃蛋白酶消化,2N HCl孵育。组织背景封闭,滴加特异性抗抗体2。IgG-TR标记荧光二抗作用,最后用DAPI孵育15min。捞片,阴干,甘油封片。 [结果] ATN组术后左肾出现明显的近端肾小管上皮细胞广泛性坏死,BrdU阳性细胞明显增加,第3天达到高峰,显著高于右肾和假手术对照组。双重染色显示BrdU阳性细胞同时表达Pax2和Vimentin,但未表达活化的Caspase-3,提示BrdU阳性细胞系处于分裂增殖的肾内源性干细胞,而非凋亡细胞。 [结论] 大鼠在经历缺血性ATN后,肾脏内源性干细胞被动员并在肾小管的修复过程中起着主要作用。