α-硫辛酸再生谷胱甘肽的机制及Nrf2/ARE信号通路的作用研究

作     者：师春立 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴志刚

授予年度：2016年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：α-硫辛酸 镉 谷胱甘肽 谷胱甘肽还原酶 Nrf2 

摘      要：α-硫辛酸(α-LA)是一种有效的自由基清除剂和天然抗氧化剂,它能清除各种自由基;螯合金属离子;再生其它抗氧化剂;再生和增强其它抗氧化酶的作用。由于α-LA具有多功能、强大、广谱、再生其他抗氧化剂的特点,因此α-LA被誉为“万能抗氧化剂。镉是一种常见的环境重金属污染物,其在自然界具广泛存在,具有“致癌、致畸、致突变的作用,是自然环境中的一种重要毒物。许多研究表明,镉诱导的各种疾病与氧化损伤密切相关,可以导致肝脏、肾脏、肺部、生殖系统、免疫系统、心血管系统等产生氧化损伤性疾病。谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的天然活性肽,谷胱甘肽在自然界以氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(r GSH)两种形态存在。r GSH在维持细胞内环境氧化还原稳态,保护蛋白质、DNA等生物大分子氧化损伤方面具有重要作用。因此,本研究从α-LA再生谷胱甘肽还原酶(GR)的角度,深入探讨α-LA再生rGSH及拮抗镉致Hep G2细胞氧化损伤的作用机制。为α-LA作为一种潜在治疗药物应用于镉致氧化损伤性疾病的治疗提供理论支持。第一部分α-LA拮抗镉致HepG2细胞氧化损伤的作用目的:探讨α-LA对CdCl2诱导HepG2细胞产生氧化损伤的作用。方法:本实验以HepG2细胞为研究对象,设一个正常组和五个处理组,分别为正常组(不施加任何处理因素);25μM CdCl2单独作用组;100μMα-LA单独作用组;25μM CdCl2+10μMα-LA联合作用组;25μM CdC l2+50μMα-LA联合作用组;25μM CdCl2+100μMα-LA联合作用组。联合作用组按上述α-LA剂量预处理8h,然后按上述分组中α-la和cdcl2浓度进行染毒处理,染毒时间为16h。用四甲基偶氮噻唑蓝(mtt)法检测hepg2细胞的活力,用dcfh-da法检测细胞内活性氧(ros)水平。结果:与正常组相比,25μmcdcl2单独作用组细胞活力显著降低(p0.01),ros的水平显著升高(p0.01);与25μmcdcl2单独作用组相比,α-la(50μm,100μm)和25μmcdcl2联合作用组的细胞活力显著升高(p0.01),α-la(10μm,50μm,100μm)和25μmcdcl2联合作用组中的ros的水平均降低(p0.01或p0.05)。结论:α-la可以拮抗cdcl2致hepg2细胞氧化应激,降低cdcl2诱导hepg2细胞产生的氧化损伤。第二部分α-硫辛酸再生谷胱甘肽机制的研究目的:从谷胱甘肽还原酶(gr)催化氧化型谷胱甘肽(gssg)再生还原型谷胱甘肽(rgsh)的途径,探究α-la再生rgsh的作用机制。方法:染毒方法和实验分组同第一部分。用rgsh和gssg检测试剂盒检测rgsh的水平及rgsh/gssg比值,用dtnb法检测gr的酶活力,用westernblotting方法检测gr的蛋白表达量,用pcr技术检测gr的mrna表达水平。结果:与正常组相比,25μmcdcl2单独作用组rgsh水平及rgsh/gssg比值显著降低(p0.01),gr酶活力降低(p0.05),grmrna表达水平降低(p0.05),gr蛋白表达量显著降低(p0.01);与25μmcdcl2单独作用组相比,α-la(50μm,100μm)与25μmcdcl2联合作用组中rgsh水平及rgsh/gssg比值显著提高(p0.01),α-la(50μm,100μm)与25μmcdcl2联合作用组中gr酶活力提高(p0.01或p0.05),α-la(10μm,50μm,100μm)与25μmcdcl2联合作用组中mrna水平显著提高(p0.01),α-la(50μm,100μm)与25μmcdcl2联合作用组中gr蛋白表达量显著提高(p0.01)。结论:α-la能够诱导grmrna基因的表达,促进gr蛋白表达量的增加,提高gr的酶活力,催化gssg转化为rgsh,促进rgsh的再生。第三部分Nrf2/ARE信号通路在α-硫辛酸再生谷胱甘肽中的作用目的:探讨Nrf2/ARE信号通路在α-LA再生r GSH中的作用。方法:染毒方法和实验分组同第一部分。用Western blotting方法检测检测p-Nrf2和Nrf2的蛋白表达量,计算出p-Nrf2/Nrf2比值,用细胞免疫化学染色法检测α-LA对Nrf2核转位的影响。结果:与正常组相比,25μM CdCl2单独作用组中p-Nrf2/Nrf2比值显著降低(P0.01);与CdCl2单独作用组相比,α-LA(10,50,100μM)与25μM CdCl2联合作用组中p-Nrf2/Nrf2比值显著升高(P0.01)。在正常组中,被染色的Nrf2几乎全部集中在细胞质中;在25μM CdCl2单独作用组和1