人诱导共刺激分子配体ICOSL单克隆抗体及ELISA试剂盒的研制及应用

作     者：胡筱涵 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张学光

授予年度：2016年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：ICOSL 单克隆抗体 ELISA 可溶性ICOSL 共刺激作用 

摘      要：T细胞活化需要双信号:第一信号是TCR(T cell receptor)识别抗原提呈细胞表面抗原肽-MHC复合物,第二信号是T细胞和抗原提呈细胞共刺激分子之间的互相作用,共同决定T细胞的活化增殖,维持并调节活化级联反应,抑或转变为无反应状态甚至凋亡。正性共刺激分子ICOS(inducible costimulator)与其配体ICOSL(inducible costimulator ligand)相互作用后能有效地促进T细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌等,还会参与Tfh(T follicular helper cells)增殖分化和生发中心反应,从而对B细胞分泌抗体发挥作用。同时ICOS/ICOSL信号通路在自身免疫性疾病、移植免疫、肿瘤免疫乃至感染性免疫的发生发展过程中具有重要的生物学功能。正性共刺激分子ICOSL以两种形式存在:可溶型和膜型。膜型ICOSL分子一定程度表达在活化的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和部分T细胞亚群,也可诱导表达于血管内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞上。ICOSL与其表达在T细胞上的受体ICOS结合,可以不依赖于B7/CD28通路作用于T细胞发挥功能。ICOS分子胞内段含有一个“YMFM基序,可与PI3K结合发挥其激酶活性,作用于下游信号通路,即ICOS/ICOSL信号途径会激活T细胞内依赖PI3K的信号途径。一般情况下可溶性共刺激分子可以通过专一的mRNA编码经免疫细胞直接分泌产生,也可以由膜型分子经蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶等)的裂解而形成。临床资料分析显示,部分可溶性共刺激分子具有临床诊断的价值,然而机体中是否存在可溶性ICOSL,它是通过何种机制产生的,表达特性如何,在对膜型ICOS/ICOSL的调节作用中扮演何种角色,在临床疾病的免疫病理中发挥何种生物学作用等,这些问题还有待研究。因此,ICOS/ICOSL信号通路对T细胞在免疫应答中的调节发挥重要的生物学作用。通过研究ICOS/ICOSL的表达及其介导的信号通路与临床疾病的关系,阐明其在免疫病理中的作用和机理,可以为某些疾病的免疫诊断和免疫治疗寻求新的途径。本课题研究旨在构建转基因细胞L929/ICOSL的基础上,研制出特异性的鼠抗人ICOSL单克隆抗体,同时分析其生物学特性,进一步探究单抗对ICOS/ICOSL途径的调节作用和对T细胞增殖及其细胞因子分泌的影响;并应用所得单抗研制特异性检测人可溶性icosl(sicosl)的elisa试剂盒,对试剂盒的精确性和稳定性进行评价;利用研制的elisa试剂盒检测健康志愿者和系统性红斑狼疮患者外周血可溶性icosl的表达水平,探究sicosl可能的产生机制,进而探讨该可溶性因子在系统性红斑狼疮免疫病理中的临床意义。上述研究结果为阐明膜型icosl和可溶型icosl的生物学意义及icos/icosl在自身免疫性疾病中的作用提供了新的线索。一、鼠抗人icosl单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究【目的】研制特异性鼠抗人icosl单克隆抗体,为探究人icosl分子在不同细胞上或多种疾病中的表达奠定物质基础,并为探讨icos/icosl信号通路的生物学意义提供物质材料。【方法】以高表达人icosl分子的转基因细胞l929/icosl免疫balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术将骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾脏细胞进行融合,运用流式细胞术对杂交瘤细胞的培养上清进行初筛,将合格的杂交瘤细胞株反复检测和亚克隆,成功获得两株特异性好且能够持续稳定分泌鼠抗人icosl单抗的杂交瘤细胞株;采取cba法和快速定性试纸法鉴定抗体亚型;通过westernblot、dotblot、细胞免疫荧光技术和elisa以及两株单抗之间或单抗与蛋白之间的竞争结合抑制实验分析所得单抗的生物学特性;用流式细胞术和间接免疫荧光分析icosl在多种肿瘤细胞表面的表达水平;研究所得单抗在人t细胞体外增殖实验中的生物学功能。【结果】1、成功获得两株稳定分泌特异性鼠抗人icosl单克隆抗体的杂交瘤细胞株:13d11和20b10。这两株单抗可用于流式细胞术、westernblot、dotblot、elisa、细胞免疫荧光技术的检测分析;2、竞争抑制实验表明,两株单抗识别icosl分子不同的抗原表位,且都与商品化单抗2d3不同;两株单抗均能有效阻断icos/icosl的结合;3、t细胞体外增殖实验结果表明,单克隆抗体13d11可抑制活化t细胞的体外增殖,且其抑制作用随单抗浓度的增加而增强。【结论】成功获得两株特异性鼠抗人icosl单克隆抗体,两者识别icosl不同的抗原表位,为研制检测人可溶性icosl的elisa试剂盒,进一步用来测定可溶性icosl的表达水平奠定了良好的物质基础;也为分析膜型icosl的表达特性,探讨icos/icosl信号通路对免疫系统