长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞系中HBV基因表达和复制

作     者：田绿 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何松

授予年度：2011年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：RNA干扰 HBV复制 反义RNA 

摘      要：目的:HBV的感染一直是困扰人类的一个问题,现有的手段并不能有效地控制其进展,而近年来对RNA干扰的研究证明其在抗病毒方面也有着巨大的潜力。本实验拟评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应。 方法:（1）将HBV基因组中S编码基因的全部核苷酸序列插入至pTARGET载体中,构建重组质粒HBS2（反向插入序列）和HBS4（正向插入序列）,并用这两种质粒转染HepG2.2.15细胞。（2）实验分为HBS2组、HBS4组、干扰素组、聚肌胞组和对照组。（3）ELISA法检测各组细胞上清中病毒抗原表达水平。（4）real time PCR法检测各组细胞内和分泌入培养基的HBV DNA水平及细胞内的HBV cccDNA水平。（5）real time RT-PCR检测各组细胞内β-干扰素mRNA水平。（6）Cellular DNA Fragmentation ELISA测定各组细胞的凋亡率。 结果:（1）PCR及测序结果显示HBS2和HBS4质粒构建成功。（2）ELISA结果显示HBS2组、干扰素组、聚肌胞组细胞上清中HBsAg和HBeAg的水平较对照组降低（P0.05）,HBS4组HBsAg水平较对照组升高（P0.05）,HBeAg水平无变化（P0.05）。（3）real time PCR结果显示HBS2组、干扰素组、聚肌胞组细胞上清中HBV DNA水平和细胞内HBV DNA、HBV cccDNA水平较对照组降低（P0.05）,HBS4组则均与对照组无差异（P0.05）。（4）real time RT-PCR结果显示HBS2组、聚肌胞组细胞内β-干扰素mRNA水平较对照组升高（P0.05）,HBS4组与对照组无差异（P0.05）。（5）Cellular DNA Fragmentation ELISA结果显示HBS2组、干扰素组和聚肌胞组细胞凋亡率较对照组升高（P0.05）,HBS4组与对照组无差异（P0.05）。 结论:长片段反义RNA能抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和病毒复制,且能诱导HepG2.2.15细胞的凋亡。