B群脑膜炎奈瑟菌NspA核酸疫苗的免疫活性及保护作用的初步研究

作     者：邓苏宏 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡四海

授予年度：2014年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：B群脑膜炎奈瑟菌 奈瑟菌表面蛋白A(NspA) 核酸疫苗 免疫活性 免疫保护 

摘      要：目的：扩增B群脑膜炎奈瑟菌表面蛋白A（NspA）基因，构建pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体，通过肌注和滴鼻法免疫雌性BALB/c小鼠，观察小鼠体内产生体液免疫和细胞免疫应答水平，计算疫苗的免疫保护率，为研究B群脑膜炎奈瑟菌核酸疫苗提供相关的实验依据。 方法：制备去内毒素的pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体，通过Lip2000转染试剂在RAW264.7和COS-7细胞中进行转染，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测nspa基因mRNA的转录水平，通过免疫组化法检测NspA基因在真核细胞中的表达水平。通过肌注和滴鼻的方式免疫3-4周龄的雌性BALB/c小鼠，采用间接ELISA法检测小鼠血清中产生的特异性IgG和生殖道黏膜灌洗液中sIgA抗体水平， ELISA双抗体夹心法检测免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4的水平，CCK8法检测脾淋巴细胞增殖反应。构建脑膜炎球菌动物感染模型，观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护率。 结果： （1）构建的pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体经公司测序及酶切鉴定结果正确。 （2） pcDNA3.1(+)/NspA真核重组载体能有效地在真核细胞中进行转录和表达。 (3)核酸疫苗通过滴鼻和肌注法免疫小鼠后，能够刺激小鼠体内产生特异性抗NspA的抗体，并且抗体水平随免疫时间递增呈上升趋势： ①在免疫后第6周，滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠生殖道灌洗液中特异性sIgA水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:3000;肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠生殖道灌洗液中特异性sIgA水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:1875;②在免疫后第6周，滴鼻法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠血清中特异性IgG水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:3750;肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的小鼠血清中特异性IgG水平明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.05），pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组抗体效价为1:5000;③经滴鼻和肌注免疫的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组小鼠脾淋巴细胞上清液中的IL-4、IFN-γ含量明显高于pcDNA3.1(+)和PBS组（P0.05）;④肌注法的pcDNA3.1(+)/NspA+CpG组的脾淋巴细胞刺激指数（SI，1.45±0.03）显著高于、PBS（0.30±0.01）与pcDNA3.1（+）组（0.44±0.02），（P0.05）;(4)核酸疫苗的免疫保护效果：①肌注法： pcDNA3.1(+)/NspA+CpG、pcDNA3.1(+)/NspA组在72h内的存活率分别为90%、80%;pcDNA3.1(+)组和PBS组24h内的存活率分别为30%和20%，48h内的存活率均为0;②滴鼻法：pcDNA3.1(+)/NspA+CpG、pcDNA3.1(+)/NspA组在72h内的存活率分别为80%、70%，pcDNA3.1(+)组和PBS组24h内的存活率分别为30%和20%，48h内的存活率均为0。 结论： （1）核酸疫苗pcDNA3.1(+)/NspA可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答;（2）核酸疫苗对B群脑膜炎球菌感染的实验小鼠具有一定的免疫保护作用，肌注途径的免疫保护作