银杏叶提取物及磷酸肌酸钠对A β25-35致PC12细胞凋亡保护作用机制研究

作     者：刘希奇 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张国华;杨国锋

授予年度：2008年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 PC12细胞 凋亡 银杏叶提取物 磷酸肌酸钠 保护 

摘      要：目的:本文通过淀粉样蛋白β(Aβ)25-35诱导PC12细胞凋亡,建立阿尔茨海默病的细胞膜型,并给予银杏叶提取物(EGB)及磷酸肌酸钠(PCr)进行干预,了解二者是否对Aβ25-35所致的神经元凋亡有保护作用。 方法:取对数生长期PC12细胞,细胞计数后,以104/mL的密度接种于96孔板中,培养24小时后,半量换液,并加入不同浓度的Aβ25-35(A:0μmol/L (对照组)、B:10μmol/L、C:20μmol/L、D:30μmol/L、E:40μmol/L)。培养24小时后测得细胞存活率,应用SPSS软件选择方差分析法进行统计分析,发现在Aβ25-35浓度为30μmol/L时对PC12细胞的损伤效果明显。按相同条件进行细胞培养24小时后加入Aβ25-35,浓度为30μmol/L,12小时后,按下面分组方法分别加入银杏叶提取物及磷酸肌酸钠:银杏叶提取物A:Aβ0umol (对照组)、B:Aβ30umol/L、C:Aβ30umol/L +EGB100mg/L、D:Aβ30umol/L+EGB200mg/L、E:Aβ30umol /L +EGB400mg/L,磷酸肌酸钠组A:Aβ0umol/L (对照组)、B:Aβ30umol /L、C:Aβ30umol/L+PCr10mmol/L、D:Aβ30umol/L + Cr20mmol/L、E:Aβ30umol/L+PCr 30 mmol /L。培养12小时后,CCK-8法测细胞存活率,统计分析后得出,银杏叶提取物组200mg/L,磷酸肌酸钠组20mmol/L对细胞保护作用明显。按上述方法用Aβ25-35浓度为30μmol/L损伤PC12细胞,12小时后予银杏叶提取物组(200mg/L), PCr组(20mmol/L)保护细胞,培养12小时后,用线粒体膜电位特异荧光探针JC-1标记PC12细胞,启动共聚焦显微镜,选择488nm氩离子激光和543nm氦氖激光作为激发光,选择530±15 nm和615±30 nm通道作为接收通道,启动计算机运行Lasersharp2000软件,扫描图象,最后将图象在Laserpix软件中进行处理。同时将浓度为104/mL的细胞,以600转/分的速度进行细胞甩片后,按TUNEL凋亡试剂盒的操作步骤检测细胞凋亡,计算细胞凋亡率,采集图像。采用SPSS统计软件进行统计学分析。 结果:在Aβ25-35浓度为30μmol/L时,对PC12细胞损伤效果明显,与0μmol/L,10μmol/L ,20μmol/L组有显著差异( P 0.01)。以不同浓度的银杏叶提取物及磷酸肌酸钠进行干预后,测量OD值,采用方差分析法得出EGB200mg/L组与Aβ30umol /L,EGB 100 mg/L组差异明显(P0.01),PCr 20 mmol/L与Aβ30umol /L,PCr 10 mmol/L组差异明显(P 0.01 ),和PCr 30mmol/L组无明显差异。线粒体膜电位示30umol/L的Aβ处理PC12细胞(简称为Aβ组,下同)24小时后,红色荧光强度明显降低,绿色荧光强度明显增强,即线粒体膜电位(MMP)降低。而以Aβ30umol/L + EGB200mg/L组处理PC12细胞(简称为银杏组,下同)及Aβ30umol/L+PCr 20mmol/L组同时处理PC12细胞(简称为磷酸肌酸钠组,下同)后,红色荧光强度明显增强,绿色荧光强度明显降低,即线粒体膜电位(MMP)升高。Aβ组(30umol/L Aβ)、EGB组(Aβ30 umol/L + EGB 200mg/L)及PCr组(Aβ30umol/L + PCr 20mmol/L)均可见TUNEL阳性细胞,即凋亡细胞,PO-D标记的凋亡细胞显绿色荧光;而以DAB显色,凋亡细胞核被染成棕色。Aβ组细胞凋亡率(63%)高于银杏组(21%)及磷酸肌酸组(22%)(p0.01)。 结论:1.浓度为30umol/L的Aβ25-35可诱导PC12细胞凋亡,建立AD的细胞膜型。2.浓度为200mg/L的银杏叶提取物及20mmol/L的磷酸肌酸钠,通过提高PC12细胞的线粒体膜电位水平,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率,从而对Aβ25-35损伤的PC12细胞起到一定的保护作用。