p53与ROS在受α射线辐射肝癌细胞所诱导旁效应中的作用

作     者：李继涛 

作者单位：复旦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵春林

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：α射线 辐射旁效应 肝癌细胞 p53 SCO2 ROS α射线 多细胞体系 辐射旁效应 p53 ROS 

摘      要：p53基因一直是肿瘤病因学、放射生物学的研究热点,但受其调控的能量代谢在辐射生物效应中的作用还存在许多未知因素,了解p53及其下游分子在受辐射肝癌细胞所诱导旁效应中的作用对评价肿瘤放射治疗疗效、辐射损伤、辐射致癌的早期筛选生物指标和分子流行病学调查均有着极其重要的意义。 近年来的研究发现,细胞受照射后产生的活性氧自由基(ROS)在辐射旁效应的发生发展中具有非常重要的作用,细胞色素C氧化合成酶2(SC02)表达异常可使线粒体ROS增加,影响线粒体氧化磷酸化功能。同时,电离辐射旁效应的产生与射线种类、细胞类型、细胞所处的环境等有密切相关。 我们最近的实验证明,p53在调控电离辐射旁效应中起到重要作用,但其与线粒体自由基分子等旁信号因子之间的关系还需进一步研究。此外,体内肿瘤组织除了肿瘤细胞外,还有许多问质细胞,多细胞体系的中间体细胞在辐射旁效应中的作用及p53对旁效应的影响也未有报道。放射治疗在肿瘤的治疗过程中有非常重要的作用,肿瘤的放射治疗方案也在不断地改进,而高LET辐射很可能成为未来放疗的主导手段,对其在肿瘤放射治疗中所介导的旁效应作用也有待研究。研究p53及其下游分子在辐射肝癌细胞所诱导旁效应中的作用,可以更好的理解肿瘤的发生发展过程,并可为肿瘤放射治疗方案的制定提供更好的临床指导。围绕p53和ROS在高LET α射线辐射下肝癌细胞所诱导的旁效应,本论文分为以下两个部分： 第一部分：p53与线粒体源性自由基在肝癌细胞诱导辐射旁效应中的作用 目的：探讨在α粒子照射条件下,p53依赖的辐射旁效应、SC02和ROS三者之间的关系。 方法：将受到40cGy的α射线照射的肝癌细胞HepG2细胞(野生型wtp53)和Hep3B细胞(缺失型null p53)与正常的人肝细胞HL-7702细胞共培养6h,以细胞胞质分裂阻滞法(CB法)检测人肝细胞HL-7702细胞的微核发生率,评价两株不同类型的肝癌细胞对旁细胞HL-7702细胞的影响。采用p53抑制剂(PFT-α)、SC02抑制剂(NaHS)、ROS清除剂DMSO分别处理受照细胞,或采用p53和SCO2siRNA转染细胞,观察其对旁细胞HL-7702微核率的影响。另外,用荧光探针DCFH-DA检测ROS的生成,Real-time PCR、酶活测定法及western blot法检测p53及SC02的表达或活性。 结果：受辐射HepG2细胞具有显著的诱导旁效应的能力,与之共培养的HL-7702细胞的微核率发生了非常明显的升高;但受40cGy照射的Hep3B细胞未能引起HL-7702细胞产生旁效应损伤。PFT-α、NaHS、DMSO、p53siRNA、SCO2siRNA等对细胞进行处理后,HepG2细胞所诱导的辐射旁效应明显减弱,说明肝癌细胞辐射诱导旁效应与p53的下游因子亦密切相关。Western blot实验证实,40cGy a粒子照射后HepG2细胞磷酸化P53明显升高,而Hep3B细胞P53蛋白无表达。PCR和酶活法检测发现：受α辐射后的HepG2中SCO2的mRNA和酶活性明显升高,p53siRNA、SCO2siRNA处理则抑制或下调这些表达：而Hep3B细胞的SCO2表达在辐射前后无变化。同时,40cGy的α射线照射后HepG2细胞ROS水平亦明显升高,并可被p53siRNA或SCO2siRNA所抑制,而p53缺失的Hep3B细胞ROS在射线照射前后没有变化。 结论：具有野生型p53基因的HepG2细胞受照射后可以对正常肝细胞HL-7702细胞产生旁效应损伤,而p53缺失型的Hep3B细胞不能诱导辐射旁效应。这表明p53分子、SCO2和辐射旁效应信号分子ROS三者之间有非常密切的关系,肝癌细胞辐射旁效应可通过p53-SCO2-ROS代谢途径进行调节。 第二部分：多细胞体系中p53对肝癌细胞诱导辐射旁效应的影响 目的：本部分重点研究多细胞体系中中间体细胞p53状态对受辐射肝癌细胞所诱导旁效应的影响。 方法：将受到40cGy a射线照射后的肿瘤细胞HepG2(野生型p53,wtp53)与未受照射的HL-7702旁细胞共培养6h,同时,在该细胞共培养体系中分别加入p53状态不同的悬浮细胞作为中间体细胞,包括人巨噬细胞U937(突变型p53)、人淋巴母细胞株***(突变型p53)、人淋巴母细胞TK6(野生型p53),用CB法检测旁细胞HL-7702的微核产生情况,观察这些中间体悬浮细胞对旁细胞HL-7702微核生成率的影响。另外,采用p53抑制剂20μmol/L PFT-α或10μm PFT-μ抑制中间体TK6细胞的p53基因,检测其对辐射旁效应的影响。同时,用流式细胞仪测定不同条件下受照射肿瘤细胞HepG2的活性氧(R