草木樨属与柑橘属药材抑制黄嘌呤氧化酶物质基础研究

作     者：郭丙花 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘坤;王威

授予年度：2016年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄嘌呤氧化酶 高尿酸血症 痛风 白花草木樨 柑橘属药材 

摘      要：黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)是体内核酸代谢中重要的酶,能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸,同时产生过氧化物自由基。尿酸浓度过高将导致高尿酸血症,高尿酸血症是引起痛风的重要生化基础。通过抑制XOD的活性降低体内尿酸的含量从而防治痛风。据文献报道,草木樨属植物白花草木樨(Melilotus Albus)和柑橘属药食同源药材枳实(Aurantii Fructus Immaturus)、青皮(Citri Reticulatae Pericarpium Viride)、陈皮(Citri Reticulatae Pericarpium)、橘红(Citri Exocarpium Rubrum)、佛手(Fructus Citri Sarcodactylis)、香橼(Citri Fructus)富含黄酮类化合物,黄酮类化合物具有较强的生物活性,包括对XOD的抑制活性。本研究课题期望通过建立白花草木樨与柑橘属药材中不同组分的指纹图谱结合体外黄嘌呤氧化酶抑制活性实验进行综合分析,分离鉴定出抑制黄嘌呤氧化酶的活性化合物并明确其物质基础与作用机制。本实验通过优化不同色谱柱、流动相组成和检测波长等色谱条件,建立了白花草木樨和柑橘属药材提取物HPLC分析方法。以黄嘌呤为底物,通过HPLC法测定尿酸生成量从而评价化合物对黄嘌呤氧化酶抑制活性强弱,利用活性筛选模型测定各不同组分对XOD抑制作用。结果显示,白花草木樨除水组分外,各萃取组分均有一定的抑制活性,其中乙酸乙酯萃取组分为有效组分(200μg/m L浓度下抑制率为66.93±1.52%)。柑橘属不同药材70%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇不同溶剂提取物的抑制活性以枳实、青皮乙酸乙酯提取物的抑制活性较高(200μg/m L浓度下枳实、青皮的抑制率分别为60.70±0.74%、50.15±0.44%)。综合运用十八烷基键合硅胶柱色谱(ODS)和制备液相色谱(Preparative HPLC)等技术从白花草木樨的乙酸乙酯萃取组分中分离得到2个活性化合物,综合运用1H-NMR、13C-NMR、MS等波谱数据鉴定其结构分别为芹菜素(化合物1)和苜蓿素(化合物2)。从枳实乙酸乙酯提取物中分离得到7个化合物,其中包括5个黄烷酮类化合物,其结构分别鉴定为:柚皮苷(化合物3)),橙皮苷(化合物4),新橙皮苷(化合物5),柚皮素(化合物6),橙皮素(化合物7);两个多甲氧基黄酮类,其结构分别鉴定为川陈皮素(化合物8)和桔皮素(化合物9)。单体化合物黄嘌呤氧化酶体外活性和酶动力学实验,发现5种单体化合物芹菜素、苜蓿素、橙皮素、川陈皮素和柚皮素具有一定的抑制活性,其中芹菜素、苜蓿素、橙皮素和川陈皮素抑制活性相对较高,IC50分别为0.42μM、4.13μM、16.48μM、107.53μM。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法确定活性化合物的抑制类型,芹菜素、苜蓿素、橙皮素为混合型,川陈皮素为非竞争型抑制。其中苜蓿素为首次从白花草木樨中分离得到的化学成分,苜蓿素与川陈皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制作用为首次报道。