大鼠腹腔注射LPS致海马CA1/CA4区损伤Junctophilin-3/4介导胶质细胞吞噬及神经新生

作     者：张艺瀚 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：楼宜嘉

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：脂多糖 炎症损伤 海马CA1/CA4区域 神经前体细胞 DG区 神经再生 Junctophilin 3 Junctophilin 4 Ca2+稳态 星形胶质细胞 小胶质细胞 吞噬 

摘      要：包括神经退行性病变在内的多数中枢神经系统疾病,均可能与外周炎症过程相关,但全身急性炎症致中枢海马损伤的早期形态学特征,及其发生发展迄今未见较全面的报道。前期研究表明腹腔给予脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)引发的中枢神经炎症对皮层、海马均有损伤,并在行为上表现为明显的短暂学习记忆能力下降。但这种急性炎症损伤主要涉及海马哪些分区及细胞类型,损伤后会产生哪些病理生理反应,及可能的相关内在机制等问题,至今未见系统研究报道,亟待进一步探索阐明。吞噬现象是特殊的细胞间相互作用,凋亡细胞如果不被及时有效清除,会发生次级细胞坏死,导致严重炎症和狼疮样自身免疫疾病的发生。因此,通过吞噬作用快速清除凋亡细胞是防止炎症对周围组织继续损伤所必须的,也是机体进行自我修复的关键。果蝇的膜连接蛋白Junctophilins (JPs)同源蛋白殡葬者蛋白(Undertaker, UTA)通过调控胞内Ca2+稳态,参与发育过程中对凋亡细胞的吞噬作用,提示哺乳动物JPs也有可能参与对神经组织凋亡细胞的吞噬作用。课题组前期研究发现,LPS诱发脑部急性炎症过程海马组织存在凋亡细胞被吞噬现象,并伴有皮层与海马组织JP3/JP4一过性上调。鉴于脑组织JP亚型3与4(JP3/JP4)主要分布在海马,本研究进一步评价LPS诱发脑部急性炎症过程海马组织是否也发生由JPs介导的吞噬作用。哺乳动物中枢神经系统具有特定内源性再生的特征,在成年大脑和脊髓的神经元轴突及主要分支,在某种损伤后可以再生。研究表明,中枢神经系统发生病理改变后,神经前体细胞会特异性地向损伤部位迁移并可替代缺失的细胞,与其他神经元建立通路,从而使受损脑组织达到形态和功能上的修复,这为神经中枢神经疾病治疗带来了希望的曙光。但在外周炎症引发中枢神经急性损伤过程,海马是否也能出现神经再生的研究报道甚少,本研究进一步探索了JP3/JP4是否介导LPS引发的海马急性损伤修复再生,以期对临床相关治疗预测性评估提供实验依据。本论文也通过第一部分相关机制的探究,尝试为内侧颞叶早期损伤有可能累积,导致50年后的临床痴呆症状作出若干较为合理的解释。第一部分腹腔注射脂多糖致大鼠海马区损伤及修复表征目的：探索腹腔注射脂多糖(LPS)致大鼠海马急性损伤及修复表征。方法：Sprage-Dawley (SD)雄性大鼠(250-300 g)腹腔注射生理盐水及LPS(2mg/kg)造模后,分别于给药后第1、4、7、10、13天收集脑组织。切片样本经灌流固定后取脑组织,而蛋白样本可直接取脑组织存于-80℃保存。组织切片H&E染色,光镜下观察海马各区域细胞形态及损伤情况,TUNEL检测组织细胞凋亡情况,免疫荧光染色后采用全海马脑片共聚焦扫描NeuN, MAP2表达与分布,检测海马各脑区锥体神经元数目及轴突完整性,并采用免疫组化进行定量分析。Western Blot检测NeuN, MAP2以及凋亡相关蛋白p-c-Jun, Bax/Bcl-2, TNF-a等的表达。Western Blot法检测神经前体细胞标志物Nestin以及β-catenin, p-STAT3的表达,免疫荧光染色法检测海马不同区域内Nestin阳性细胞的表达分布情况。结果：组织切片H&E染色显示生理盐水组,大鼠海马各区域锥体细胞排列整齐,突触完整,细胞核较大,核仁明显,胞浆均匀饱满,细胞边界清晰。大鼠给LPS后第4天,锥体神经元出现核固缩,出现大量的组织空泡,细胞数目减少,排列不规则并伴有明显的轴突损伤。给LPS后第7天上述损伤出现逆转,第13天基本恢复。上述变化在海马CA1, CA4区域最为明显,因此本研究主要评价海马该两个区域。TUNEL与Western Blot检测结果分别显示,给LPS后第4天,海马CA1, CA4区域细胞凋亡增加;凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值,TNF-α表达上调,提示海马区域细胞发生凋亡。激光共聚焦全海马脑片扫描技术,对整个海马结构神经元阳染细胞进行扫描,结果显示,LPS给药后第4天海马CA1区锥体神经元数目减少,排列紊乱。CA4区除上述现象更甚外,尚有轴突受损,细胞层出现明显缺失等现象。但至第7天上述损伤开始恢复,直至第10天、第13天海马CA1、CA4区域锥体神经元数目及排列与对照组无显著性差异。免疫组织化学染色后,对CA1, CA4区域内神经细胞数量进行统计,结果显示,给LPS后第4天海马CA1、CA4两个区域神经元数目均显著下调,第7天开始恢复。提示LPS损伤大鼠海马CA1, CA4区域神经元,而对海马其他区域及其他类细胞无明显损伤,该形态学损伤可在3天内基本修复。给LPS后第4天,Nestin表达显著上调,免疫荧光染色结果提示神经前体细胞激活,启动前体细胞分化,参与修复损伤。同时海马CA1的Slm区域出现由神经前体细胞组成的管状结构,即神经玫瑰花结。该结构的出现提示神经组织处于神经元新生的修复前期。同时LPS给药后第4天,海马DG区外沿出现明显的Nestin阳染新生神经前体细胞,同时,海马CA1, CA4等区域也有少量神经前体细胞。以上结果提示,大鼠腹腔注射LPS致海马急性损伤后,DG区存在的神经前体细胞可被激活,并且呈明显的迁移迹象。给LPS后第4天,海马区p-STAT3表达明显上调,提示STAT3磷酸化入核,启动下游转录调控,可能与激活神经祖细胞分化修复损伤相关。结论：大鼠LPS腹腔注射主要损伤海马CA1, CA4区域,表现为锥体神经元数量减少,尤以第4天为甚;且可能与第4天DG区神经前体细胞代偿性增殖相关。第二部分腹腔注射脂多糖致大鼠海马Junctophilin-3/4介导的吞噬现象目的：探究腹腔注射LPS致大鼠海马损伤过程中Junctophilin-3/4介导的吞噬现象方法：Sprage-Dawley (SD)雄性大鼠(250-300 g)腹腔注射生理盐水及LPS(2mg/kg)造模后,分别于给药后第1、4、7、10、13天收集脑组织。供切片样本经灌流固定后取脑组织,而蛋白样本直接取脑组织存于-80℃保存。免疫荧光法检测海马星形胶质细胞标志物GFAP与JP3,小胶质细胞Iba-1与JP3的共染率。免疫荧光染色定量胶质细胞中JP3的表达。采用Western Blot法检测大鼠海马区JP3、LTCC、SK、RyRs、NMDAR和磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKII)的表达情况。采用免疫共沉淀法,分别探索JP3与LTCC, JP3与NMDAR, JP3与RyR1、 RyR2、RyR3, JP3与SK, JP4与LTCC, JP4与NMDAR, JP3与RyR3蛋白间相互作用。采用Western Blot检测大鼠海马区JP3, JP4,吞噬受体Megf10,胶质细胞GFAP及Iba-1的表达。免疫荧光染色检测JP3分别与Megf10, GFAP, Iba-1共定位的情况。免疫共沉淀法检测JP3与Megf10, JP4与Megf10的蛋白间相互作用。结果：大鼠腹腔给LPS后第4天,海马区JP3上调,为进一步确认JP3高表达细胞,免疫荧光法检测海马区不同种类细胞中的JP3表达情况。星形胶质细胞与小胶质细胞中JP3显著上调,锥体神经元中的JP3表达未出现明显的上调。提示LPS虽未明显影响海马锥体神经元膜连接复合物JP3,但上述两种胶质细胞中JP3特异性高表达,其作用的进一步阐明对海马锥体神经元炎症损伤有重要意义。为进一步探究JP3在不同类型细胞的作用,收集海马CA1区组织进行蛋白检测,结果显示海马CA1区LTCC, RyR3与NMDAR表达上调,而CaMKⅡ磷酸化水平降低,提示胞内Ca2+浓度下调。该现象提示海马锥体神经元在感染性炎症时,可能损伤Ca2+经由LTCC内流,进而影响胞内Ca2+稳态。免疫共沉淀结果显示,JP3与NMDAR, JP3与RyR3间相互作用减少,提示胞内JP3直接调控RyR3相互作用对Ca2+在内质网贮存受到抑制,进而影响胞内Ca2+的稳态。而JP4与LTCC, JP4与NMDAR, JP3与RyR3的免疫共沉淀结果显示,JP4并非直接参与RyR3、LTCC等蛋白的调控。为进一步探究JP3/4在星形胶质细胞及小胶质细胞中的作用,首先考察两类胶质细胞的激活状态,结果显示给LPS后第4天,海马组织星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物Iba-1表达明显上调,免疫荧光染色结果与Western Blot结果相一致,提示该区域胶质细胞激活,启动对凋亡细胞的吞噬。同时海马CA1、CA4区域星形胶质细胞标志物GFAP、JP3以及Megf10表达上调,同时GFAP分别与JP3、Megf10有很好的共定位,提示星形胶质细胞表面Megf10被激活引发吞噬,该过程有JP3的参与。小胶质细胞出现上述类似现象。为进一步论证JP3在吞噬中的作用,采用免疫共沉淀检测JP3与Megf10蛋白间相互作用,结果显示JP3与Megf10并不存在蛋白间相互作用,提示JP3并非直接调控Megf10参与吞噬。本文第二部分已论证了JP3参与调控外周LPS致炎海马星形胶质细胞及小胶质细胞胞内Ca2+浓度,提示可经由调控Ca2+浓度参与吞噬。为进一步探究JP4在神经炎症中的作用,采用Western Blot法检测海马区JP4的表达,结果显示给LPS后第4天,海马区JP4表达明显上调。免疫荧光染色结果显示,海马CA1区JP4和Megf10表达上调,呈较好共定位,提示Megf10表达的细胞中存在JP4的表达。免疫共沉淀结果显示JP4与Megf10存在蛋白间相互作用,提示JP4高表达可能参与调控Megf10吞噬作用。结论：大鼠腹腔注射LPS后,海马CA1区JP3与NMDAR及RyR3间相互作用减弱。JP4与Megf10相互作用,推测参与星形胶质细胞和小胶质细胞吞噬。