人脂肪间充质干细胞外泌体对毒邪侵袭PC12细胞模型的修复作用及机制的研究

作     者：李超 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘晶

授予年度：2016年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：人脂肪间充质干细胞 外泌体 PC12细胞 神经元 兴奋毒 

摘      要：目的:观察人脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSC)来源的外泌体(exosomes)是否对毒邪侵袭(谷氨酸兴奋毒损伤)的PC12细胞模型具有保护作用和修复作用,并讨论其可能的机制,为AMSCs来源外泌体的进一步探索提供理论依据和实验基础。方法:本实验主要分两部分进行:第一部分首先大量培养人脂肪间充干细胞,传代至第三代后收集其不含血清的条件培养基,通过超速离心法去除细胞碎片和杂质,得到人脂肪间充质干细胞来源的外泌体,采用透射电镜技术观察所得外泌体的形态特征进行鉴定,采用BCA试剂盒初测外泌体浓度备用;建立毒邪侵袭PC12细胞模型,参考本实验室既往研究结果,采用不同浓度外泌体作用于该细胞模型,共孵育不同时间,通过台盼蓝染色和LDH检测对比不同浓度外泌体在不同共孵育时间下对损伤细胞的作用,确定最适宜的外泌体浓度和作用时间。在本实验第二部分中,通过酶消化法分离培养新生SD大鼠大脑皮质神经元并通过MAP2免疫荧光染色法对神经元进行鉴定;大量收集PC12细胞和神经元的条件培养基,通过超速离心法提取PC12细胞来源和神经元来源的外泌体;建立毒邪侵袭PC12细胞模型和神经元模型,按照第一部分结果加入AMSCs外泌体作用于损伤细胞,通过LDH和MTT观察其作用效果,同时通过NAD+/NADH检测和Lc3II/I抗体检测来探索AMSCs外泌体作用于PC12细胞的可能作用机制。结果:经过原代提取和传代培养,可以获得人脂肪间充质干细胞,从其条件培养基中通过超速离心法得到了30-100nm的微囊泡结构,透射电镜检测证明所得微囊泡即外泌体。采用谷氨酸和甘氨酸混合损伤PC12细胞,镜下可见细胞皱缩变圆,贴壁能力变差,LDH检测和台盼蓝染色提示细胞受损,在谷氨酸浓度为40μmol/l时细胞损伤率接近50%,向损伤PC12细胞模型中加入不同浓度的外泌体,结果显示最佳治疗浓度为40ng/μl,最佳孵育时间为12h。原代培养SD大鼠皮质神经元,细胞生长状态良好,能够正常生长至12天左右,培养第9天通过MAP2免疫荧光检测并拍照,可见细胞生长良好,神经纤维丰富。不同浓度谷氨酸加入神经元中,LDH检测确定最适谷氨酸浓度,建立毒邪侵袭神经元模型,并采用第一部分所得条件,将人脂肪间充质干细胞来源的外泌体作用于损伤的神经元细胞,检测MTT和LDH释放率均无显著变化。通过NAD+/NADH检测PC12细胞模型的能量代谢变化,结果提示人脂肪间充质干细胞外泌体对PC12细胞的能量代谢并无显著影响。通过免疫印记实验(Western Blot)检测各组PC12细胞Lc3II/I的表达,证明外泌体可以通过增强PC12细胞自噬来保护受损细胞。结论:人脂肪间充质干细胞来源的外泌体可以有效降低毒邪侵袭(谷氨酸兴奋毒损伤)PC12细胞模型的LDH释放率,对PC12细胞具有保护作用;人脂肪间充质干细胞来源的外泌体对谷氨酸损伤的神经元模型无显著效果;人脂肪间充质干细胞外泌体对PC12细胞的保护作用与能量代谢无显著关联,与自噬作用有关。