肝素酶通过诱导血管内皮细胞凋亡促进肝癌细胞跨内皮迁移

作     者：陈晓鹏 叶蕊 戴大飞 伍玉海 俞远林 程斌 CHEN Xiaopeng;YE Rui;DAI Dafei;WU Yuhai;YU Yuanlin;CHENG Bin

作者机构：皖南医学院弋矶山医院肝胆一科安徽芜湖241001 

出 版 物：《南方医科大学学报》 (Journal of Southern Medical University)

年 卷 期：2020年第40卷第8期

页      面：1065-1071页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81272412) 安徽高校自然科学基金重大项目(KJ2018ZD026)。 

主　　题：肝素酶 肝细胞癌 跨内皮迁移 微血管内皮细胞 凋亡 

摘      要：目的探索肝癌肝素酶(HPSE)对微血管内皮细胞(MVECs)凋亡及跨细胞迁移的影响。方法用qRT-PCR和Western blot法从HepG2,BEL-7402和HCCLM3三种肝癌细胞中筛选高表达HPSE的肝癌细胞;构建含有HPSE之RNA干扰序列的慢病毒载体(LV-HPSE-RNAi-1249-2,RNAi组),用含有阴性对照序列的慢病毒载体(LV-HPSE-Control,Control组)作为对照,分别感染肝癌细胞,并验证感染效率。用人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)代表肝癌MVECs,用Transwell小室行肝癌细胞跨内皮迁移试验;肝癌细胞和HUVECs细胞非接触共培养24 h,应用CCK-8法检测内皮细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况,电镜观察细胞形态。肝癌细胞腹腔注射法制作裸鼠肝癌模型,观察肝癌MVECs凋亡及癌细胞跨内皮成瘤情况。结果从3种肝癌细胞中筛选出高表达HPSE的HCCLM3肝癌细胞。慢病毒载体分别感染HCCLM3细胞72 h后,荧光显微镜显示细胞感染效率达到70%以上,qRT-PCR和Western blot法检测RNAi组肝素酶mRNA和蛋白表达下降(P0.05)。RNAi组肝癌细胞跨内皮迁移率为0.39,显著低于Control组的0.62(P0.01)。HCCLM3细胞与HUVECs非接触共培养,RNAi组内皮细胞成活率为1.14,显著高于Control组的0.77(P0.05);RNAi组凋亡指数3.94±1.51明显低于Control组(12.53±0.55)(P0.05)。透射电镜示RNAi组细胞形态大致正常;Control组内皮细胞体积变小、变形,胞膜有发泡现象;染色质浓缩、边缘化,部分分割成块状,并见凋亡小体。实验裸鼠全部成活,Control组6只肝组织中均出现GFP标记的肿瘤细胞,镜下成瘤率100%(6/6),显著高于RNAi组成瘤率(33.3%,2/6)(P0.05)。光镜下Control组肝组织内可见肝癌细胞,部分血管内皮细胞坏死,胞浆可见空泡,核质浓缩;RNAi组肝组织内罕见肝癌细胞,内皮细胞基本正常。结论肝癌肝素酶可能通过诱导血管内皮细胞凋亡而促进癌细胞转移。