二硫键Cys139-Cys206影响人胰蛋白酶的稳定性

作     者：王之可 马强 李强 刘晓 李素霞 WANG Zhi-Ke;MA Qiang;LI Qiang;LIU Xiao;LI Su-Xia

作者机构：华东理工大学生物反应器国家重点实验室上海200237 上海雅心生物技术有限公司上海200231 

出 版 物：《中国生物化学与分子生物学报》 (Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology)

年 卷 期：2020年第36卷第5期

页      面：583-591页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

基　　金：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室资助。 

主　　题：二硫键 重组人源阳离子胰蛋白酶 重组人源阴离子胰蛋白酶 稳定性 突变体 

摘      要：胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2的氨基酸序列和三维结构,二者的氨基酸序列同源性为95%,rht1比rht2多1对二硫键Cys139-Cys206。为解释该二硫键对其稳定性的作用,构建rht1的Cys139-Cys206二硫键缺失突变体rht1-dC139S-C206S和rht2的增加该对二硫键的突变体rht2-S139C-S206C。进行了重组表达和纯化,并测定rht1、rht2及两个突变体的酶学性质,对比其稳定性。结果发现,与野生型rht1、rht2相比,突变体的酶学动力学参数km和kcat值与最适pH均未有较大差异。但在pH3~12条件下的稳定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。对比其热稳定性,40℃保温4 h,rht1残余活性为92.4%,而rht1-dC139S-C206S降为60%。60℃保温4 h,rht2-S139C-S206C残余活性为83.3%,而rht2完全失活。表明了该二硫键Cys139-Cys206对人胰蛋白酶稳定性的重要性。进一步进行结构模拟和分析,解释了该对二硫键对稳定性影响的机制。