基于SSUrRNA基因序列的间日疟原虫LAMP检测技术的建立

作     者：高世同 张仁利 黄达娜 张荣锦 耿艺介 李晓恒 吴少庭 

作者机构：深圳市疾病预防控制中心广东深圳518055 广东药学院广东广州510224 

出 版 物：《中国病原生物学杂志》 (Journal of Pathogen Biology)

年 卷 期：2011年第6卷第3期

页      面：197-200页

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：深圳市科技计划资助项目(No.200902090) 

主　　题：疟原虫,间日 核糖体核糖核酸 核酸扩增技术 

摘      要：目的克隆分析间日疟原虫小亚基亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)特异性基因序列,建立间日疟原虫环介导等温扩增(LAMP)检测技术。方法针对间日疟原虫SSUrRNA种特异性基因序列设计1对引物,采用聚合酶链反应(PCR)从血样核酸提取物中扩增SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy载体连接,构建重组质粒并转化大肠埃希菌JM109,PCR与双酶切鉴定筛选阳性克隆并测序,设计6条寡核苷酸片段,LAMP检测感染血样中间日疟原虫DNA,扩增产物作琼脂糖电泳分析或直接荧光染色肉眼观察。结果间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小约为235 bp;阳性克隆重组质粒插入的SSUrRNA基因扩增片段含有235个核苷酸,与GenBank中的Sal-1株、Belem株间日疟原虫相同序列进行比对,同源性为100%,与PV2008/TR/DEL株、PVK1294株、E1 Salvador株的同源性均为99%,与三日疟原虫、卵形疟原虫及恶性疟原虫的序列同源性均低于95%。将含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以蒸馏水倍比稀释后做LAMP,试验的灵敏度为10 copy/μl;特异性检验显示间疟原虫患者血样DNA呈阳性反应,恶性疟原虫、弓形虫、日本血吸虫、华支睾吸虫感染者及正常人血DNA为阴性。结论扩增、克隆的间日原虫SSUrRNA基因序列不同地理株间同源性高,以其为靶基因建立的间日疟原虫LAMP检测技术灵敏度高、特异性好,且无需昂贵的仪器设备,具有推广应用价值。