单增李斯特菌溶血素O的PEST序列激活ERK1/2磷酸化的作用

作     者：马天天 杭奕 陶旗 俞晓蓉 祝艺然 宋厚辉 程昌勇 Tiantian Ma;Yi Hang;Qi Tao;Xiaorong Yu;Yiran Zhu;Houhui Song;Changyong Cheng

作者机构：浙江农林大学动物科技学院动物医学院浙江杭州311300 

出 版 物：《微生物学报》 (Acta Microbiologica Sinica)

年 卷 期：2020年第60卷第2期

页      面：349-358页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(31872620,31770040) 浙江省自然科学基金(LY17C180001,LZ19C180001,LQ19C180002) 国家级大学生创新创业训练计划(201810341024) 浙江省大学生科技创新活动计划基金(2018R412037) 

主　　题：单核细胞增多性李斯特菌 溶血素O PEST序列 膜裂解活性 ERK1/2磷酸化 

摘      要：[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的关键结构域PEST序列(包含S44、S48和T51关键磷酸化位点)突变体,并针对其生物学功能展开研究。[方法]以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因,克隆至pET30a(+)原核表达载体,在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒,转入*** Rosetta感受态细胞中,诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性,并通过Western blotting检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。[结果]结果显示,本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH5.5和7.4条件下,LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性,说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现,重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。[结论]研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需,且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。