亚洲璃眼蜱成蜱不同发育期miR-451与MIF表达谱的动态分析
Dynamic Analysis of Expression Level of miR-451 and MIF Gene in Different Developmental Stages of Adult Hyalomma asiaticum作者机构：中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室 扬州大学/江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心
出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)
年 卷 期：2015年第48卷第21期
页 面：4366-4373页
核心收录：
学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
基 金：国家自然科学基金(31201899,31471967) 农业科技创新工程(ASTIP) 农业部肉牛牦牛项目(NBCIS CARS-38)
主 题：亚洲璃眼蜱 微小RNA(microRNA) miR-451 巨噬细胞抑制游走因子 MIF
摘 要：[目的]micro RNA(miRNA)作为一类内源性的非编码RNA,仅有18—25 nt,其广泛存在于动植物细胞中,可诱导生物基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。以亚洲璃眼蜱为研究对象,对miR-451及其靶基因(巨噬细胞游走因子,MIF)在相互作用关系进行分析。[方法]参考miR-451成熟体序列(AAA CCG UUA CCA UUA CUG AGU UU)来自研究单元亚洲璃眼蜱高通量测序所获得的结果。根据该成熟体序列设计stem-loop及PCR引物,RT-PCR扩增获得蜱源性miR-451序列;并对不同物种来源的miR-451序列特征进行分析。基因合成方法获得抑制miR-451的ds RNA序列,用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射。参考美洲钝眼蜱MIF基因(登录号:AF289543.2),设计亚洲璃眼蜱的特异性实时荧光定量引物,以β-actin作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测注射ds RNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同发育时间点MIF基因的表达水平,以及miR-451的表达谱特征。[结果]琼脂糖凝胶电泳检测miR-451的PCR产物条带与预期大小一致,为72 nt。不同物种来源的miR-451具有较高的保守性,特别是种子序列极度保守,仅在短尾负鼠miR-451成熟体的19位点处存在A→U的突变。miR-451的RNA干扰实验证实,0-30 h miR-451表达逐渐上调,6 h达到最高值,其拷贝数为1.0×108。随后表达丰度逐渐降低。30 h其表达水平与PBS对照组相同。48-60 h miR-451再次出现一个表达上调微小变化过程。而miR-451抑制后的MIF直到30 h才有表达的上调,42 h达到峰值(拷贝量仅为9.0×103),此后其表达规模受到抑制,48 h时与PBS对照组水平一致。84 h后表达才逐渐上调,直到90 h达到峰值,并呈现正态分布趋势。[结论]利用RT-PCR获得亚洲璃眼蜱成蜱阶段miR-451序列,生物信息学方法分析了miR-451序列在不同物种间具有较高保守性。miRNA的保守性决定其靶标基因的特异性,因此,以上结果提示miR-451在动物细胞中可能扮演重要的生物学功能,是MIF功能发挥的一个重要调控因子。MIF作为miR-451靶标基因,其功能的实现可能受该miRNA的调控。基于此类推测q PCR及RNA干扰分析表明,miR-451参与了MIF的表达调控。且是一种负调控作用。当miR-451表达量升高时,MIF表达量明显下调。此研究首次证实miR-451在亚洲璃眼蜱成蜱发育阶段的表达是一种普遍现象,且对MIF存在负调控作用。这一研究为后期miR-451参与蜱的免疫应答及miR-451与靶标基因的相互作用机制提供了参考。同时证明,miRNA参与基因功能的调控具有一定的特异性和时序性。
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