CRISPR/Cas9系统介导的miR-155基因敲除细胞的制备

作     者：李聪聪 张永辉 赵婉霞 吴姣 韩浩园 李梦云 牛晖 宋素芳 李婉涛 LI Cong-cong;ZHANG Yong-hui;ZHAO Wan-xia;WU Jiao;HAN Hao-yuan;LI Meng-yun;NIU Hui;SONG Su-fang;LI Wan-tao

作者机构：河南牧业经济学院动物科技学院郑州450046 河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心郑州450046 郑州市动物生殖分子调控重点实验室郑州450046 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2019年第35卷第11期

页      面：231-239页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金项目(31702102) 河南省高等学校重点科研项目(18A230002) 河南牧业经济学院博士启动资金项目(53000139) 郑州市1125创新领军人才项目(2016XL003) 

主　　题：CRISPR/Cas9 miR-155 敲除 猪肺泡巨噬细胞 

摘      要：为研究miR-155基因在猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21)中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系。首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向miR-155的特异性sgRNA引物序列。然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞。最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、western blot等方法检测敲除效率,发现miR-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42%;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR结果显示miR-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高。成功构建miR-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨miR-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型。