重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

作     者：倪碧娴 吴小珉 刘燕红 徐祥珍 应清界 曹俊 戴洋 NI Bi-Xian;WU Xiao-Min;LIU Yan-Hong;XU Xiang-Zhen;YING Qing-Jie;CAO Jun;DAI Yang

作者机构：国家卫生健康委员会寄生虫病预防与控制技术重点实验室、江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室、江苏省血吸虫病防治研究所无锡214064 江南大学公共卫生研究中心 江苏省奇天生物科技有限公司 

出 版 物：《中国血吸虫病防治杂志》 (Chinese Journal of Schistosomiasis Control)

年 卷 期：2019年第31卷第4期

页      面：388-392,399页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 0906[农学-兽医学] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：江苏省“科教强卫工程”项目(ZDXKA2016016) 省属公益类科研院所自主科研项目(BM2018020) 江苏省青年医学人才项目(QNRC2016622) 江南大学公共卫生研究中心青年项目(JUPH201832) 

主　　题：隐孢子虫 核酸检测 重组酶介导的等温扩增法 荧光探针 检测效能 

摘      要：目的建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系;分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50μL;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。