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利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

Rapid Disruption of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus orf60 by Red Recombination System

作     者:王强 郭忠建 姚勤 王海燕 陈克平 WANG Qiang;GUO Zhong-Jian;YAO Qin;WANG Hai-Yan;CHEN Ke-Ping

作者机构:江苏大学生命科学研究院镇江212013 

出 版 物:《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期:2007年第23卷第5期

页      面:801-805页

核心收录:

学科分类:0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基  金:江苏大学高级人才基金(No.1283000169) 国家重点基础研究发展计划(973)项目(No.2005CB121000) 

主  题:Red重组系统 orf60 基因敲除 

摘      要:用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。

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