一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

作     者：陈凯 孙国梁 宋高原 李爱丽 谢传晓 毛龙 耿帅锋 CHEN Kai;SUN Guo-Liang;SONG Gao-Yuan;LI Ai-Li;XIE Chuan-Xiao;MAO Long;GENGShuai-Feng

作者机构：中国农业科学院作物科学研究所 

出 版 物：《作物学报》 (Acta Agronomica Sinica)

年 卷 期：2019年第45卷第6期

页      面：848-855页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 0902[农学-园艺学] 

基　　金：国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08009-001)资助~~ 

主　　题：CRISPR/Cas9-VQR 定点突变 PAM 基因突变 

摘      要：CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM(proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V,1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q,1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%~70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%~70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。