E4F1真核表达载体的构建及与p53的相互作用

作     者：廉攀峰 程龙 关鑫 邹大阳 梅玲 沈媛 任伟 张菊会 叶棋浓 王恩群 LIAN Pan-feng;CHENG Long;GUAN Xin;ZOU Da-yang;MEI Ling;SHEN Yuan;REN Wei;ZHANG Ju-hui;YE Qi-nong;WANG En-qun

作者机构：安徽医科大学附属安庆市立医院口腔颌面外科安徽安庆246003 军事医学科学院生物工程研究所北京100850 

出 版 物：《军事医学》 (Military Medical Sciences)

年 卷 期：2014年第38卷第1期

页      面：53-56页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：北京市自然科学基金资助项目(5132027) 

主　　题：E4F1 p53 蛋白相互作用 

摘      要：目的：构建E4 F1野生型及缺失32～81位氨基酸的真核表达载体，检测其与p53的相互作用及对下游基因p53的调节。方法分别用普通PCR和重组PCR方法从乳腺文库中扩增E4F1野生型编码序列及缺失32～81位氨基酸的突变型序列，分别将其以正确相位构建到pXJ40-MYC载体中，得到重组质粒MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81），分别转化大肠杆菌DH5α，重组质粒经酶切鉴定并转染293 T细胞， Western印迹检测蛋白的表达。将MYC-E4F1和MYC-E4F1（Δ32-81）质粒与FLAG-p53质粒共转染293T 细胞，免疫共沉淀实验检测其相互作用，野生型及缺失突变型表达载体共转染骨肉瘤细胞U2OS，检测其对下游基因p53的调节。结果 E4F1重组质粒及其突变型构建成功，在293 T细胞中鉴定表达正确，野生型及突变型E4 F1均与p53存在相互作用，突变型的结合能力增强，野生型E4F1升高p21蛋白表达水平，而突变型不改变p21蛋白水平。结论成功构建E4F1野生型及缺失32～81位氨基酸的突变型真核表达载体，二者都能与p53相互作用且突变型结合能力更强，野生型E4F1升高基因p53的靶基因p21的蛋白表达水平，而突变型不改变靶基因p21的蛋白水平。该研究为进一步研究E4 F1对p53的调节及其机制奠定了基础。