通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性(英文)
Increasing specificity of real time PCR to detect microRNA through primer design and annealing temperature increase作者机构：北京大学人民医院临床分子生物学研究所中心实验室北京100044
出 版 物：《北京大学学报（医学版）》 (Journal of Peking University:Health Sciences)
年 卷 期：2009年第41卷第6期
页 面：691-698页
核心收录：
学科分类：0710[理学-生物学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学]
主 题：微RNAs 逆转录聚合酶链反应 DNA引物 基因表达谱
摘 要：目的:了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法:采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果:提高退火温度12℃～14℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′末端置于miRNA第18～20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论:精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。
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