含绿色荧光蛋白和PLC_Z的逆转录病毒载体的构建及其在SHG44细胞中的表达
Construction of retroviral vector containing green fluorescent protein and PLC_Z and its expression in SHG44 glioma cells作者机构：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所陕西西安710033 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室陕西西安710033
出 版 物：《第四军医大学学报》 (Journal of the Fourth Military Medical University)
年 卷 期：2001年第22卷第23期
页 面：2125-2129页
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
基 金：国家自然科学基金资助项目 ( 39970 75 2 )
摘 要：目的 构建含有 PL C- γ1分子 Z区 (PL CZ)和绿色荧光蛋白基因的双顺反子逆转录病毒载体 ,并将其导入 SHG44胶质瘤细胞中 ,以探索 PL C-γ1分子对胶质瘤细胞侵袭作用的影响 .方法 PCR法扩增 PL Cz基因 ,测序后克隆入p IRES- EGFP荧光蛋白表达载体中 ,酶切鉴定重组体 .将PL Cz- IRES- EGFP片段克隆入逆转录病毒载体 p L XSN的相应位点 ,构建含有 PL Cz和 EGFP基因的逆转录病毒载体 ,脂质体介导下转染包装细胞 PA317,G418筛选并检测病毒滴度后挑选细胞克隆 .病毒上清感染人脑胶质瘤 SHG44细胞 ,G418筛选获得稳定转染细胞 ,PCR检测外源基因的整合 ,Northern blot检测外源基因的转录 ,Western blot和荧光显微镜分别检测 PL Cz分子和 EGFP的表达 .结果 PCR扩增得到大小约 6 5 0 bp的特异性条带 ,序列测定结果与发表序列一致 .构建得到含有 PL Cz和 EGFP基因的双顺反子逆转录病毒载体 ,转染人脑胶质瘤细胞 SHG44 ,得到稳定转染的细胞株 SHG44 - ***扩增显示目的片段已整合入细胞基因组 .Northern blot分析显示为单一的转录本 .Western blot可见大小约 5 0× 10 3的特异性条带 ,荧光显微镜检测显示EGFP获得良好表达 .结论 成功构建含有 PL Cz和绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体 ,并获得稳定转染该载?
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