体外转录法制备SARS冠状病毒RNA片段

作     者：张克斌 戢福云 光丽霞 周世文 钱桂生 

作者机构：第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 第三军医大学新桥医院医学实验技术中心重庆400037 

出 版 物：《第三军医大学学报》 (Journal of Third Military Medical University)

年 卷 期：2005年第27卷第24期

页      面：2472-2474页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：重庆市攻关课题(2003年紧急启动项目)~~ 

主　　题：SARS冠状病毒 RNA片段 体外转录 RT-PCR 

摘      要：目的通过体外转录获得SARS冠状病毒RNA片段,为建立RTPCR和荧光定量PCR诊断方法提供阳性对照。方法根据GenBank登录SARS冠状病毒Tor2株基因组序列,选择基因组中18138-18327nt作为目的扩增序列,并将其分解为首尾重叠的3个片段,人工合成对应的单链DNA序列,通过退火延伸获得全长dsDNA片段,PCR扩增该片段后,连接至载体pMD18T上,筛选含目的插入片段的阳性重组质粒pMD18TSARS,用BamHⅠ和HindⅢ切出目的片段,连接至线性化表达性质粒pGEM上;筛选阳性重组质粒pGEMSARS,测序鉴定后,经HindⅢ酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,得到含SARS冠状病毒目的序列的RNA片段,转录产物经电泳观察后,用RTPCR验证。结果获得含SARS冠状病毒目的基因序列的RNA片段。结论该RNA片段可用于SARS冠状病毒RTPCR和荧光定量RTPCR诊断方法的阳性对照。