CRISPR/Cas9介导h FAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合

作     者：广璐 张英 郭晶 白春玲 魏英 于超然 扈廷茂 李光鹏 GUANG Lu;ZHANG Ying;GUO Jing;BAI Chun-Ling;WEI Zhu-Ying;YU Chao-Ran;HU Ting-Mao;LI Guang-Peng

作者机构：内蒙古大学省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室 

出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)

年 卷 期：2019年第27卷第1期

页      面：12-22页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家转基因生物新品种培育科技重大专项(No.2016ZX08007-002) 

主　　题：CRISPR/Cas9 脂肪酸去饱和酶基因3(FAD3) 定点整合 核基质结合区(MAR) 牛 

摘      要：亚麻(Linum usitatissimum)脂肪酸去饱和酶基因3(fatty acid desaturase 3, FAD3)是一种脂肪酸脱氢酶基因,编码ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)脱氢酶,能够将ω-6 PUFAs转化成ω-3PUFAs。本研究利用CRISPR/Cas9介导,将无抗性、无标记的人(Homo sapiens)源化h FAD3基因表达载体C2(5’同源臂-CAG-hFAD3-PolyA-3’同源臂)和M2(5’同源臂-MAR-CAG-hFAD3-PolyA-MAR-3’同源臂)定点敲入牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞NCAPG-LCORL位点。运用气质联用仪对脂肪酸含量进行分析,结果表明hFAD3转基因细胞中ω-6/ω-3 PUFAs比值(0.565)较非转基因细胞(1.549)显著下降(P0.01)。qRT-PCR结果表明h FAD3基因整合并表达后,脂肪分解相关的过氧化物酶体增殖物激活受体基因(peroxisome proliferator activated receptor1, PPARg)、激素敏感脂肪酶基因(hormone-sensitive lipase, LIPE)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)表达总量上调倍数大于脂肪合成相关的乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl CoA carboxylase, ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl CoA desaturase, SCD)和脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase, FASN)表达总量,说明hFAD3基因的表达使得细胞内的脂肪趋于分解。通过流式分选获得59株C2打靶载体单克隆细胞株,PCR鉴定及测序结果表明,其中定点整合阳性单克隆细胞3株,定点整合效率为5.1%。同时检测定点整合阳性单克隆细胞株中脂肪酸的含量以及脂肪相关基因的表达量,结果与转染后细胞一致。比较有无核基质结合区(matrix attachment region, MAR)序列介导两种转基因细胞中hFAD3基因的表达量,结果显示,MAR介导组是无MAR组的5.91倍(P0.01)。本研究利用CRISPR/Cas9介导可实现hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合以及在细胞水平正常行使其生物学功能,同时MAR的介导可显著提高外源基因的表达量,为安全高效生产转基因动物提供科学依据。