山羊伪结核棒状杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

作     者：马玉馨 李文贵 郑国英 邬培昆 邵庆勇 李志明 高华峰 MA Yuxin;LI Wengui;ZHENG Guoying;WU Peikun;SHAO Qingyong;LI Zhiming;GAO Huafeng

作者机构：云南农业大学云南昆明650201 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650024 昆明市西山区畜牧兽医站云南昆明650101 

出 版 物：《畜牧与兽医》 (Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2018年第50卷第10期

页      面：82-87页

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：昆明市西山区2016年度科技项目 国家现代肉羊产业技术体系项目(CARS-39) 

主　　题：伪结核棒状杆菌 磷脂酶D基因(PLD) 实时荧光定量PCR 

摘      要：为了快速检测无临床症状的山羊是否感染山羊伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）,根据Gen Bank中伪结核棒状杆菌磷脂酶D（phospholipase D,PLD）基因序列,分别设计1对特异性引物和Taq Man探针,经过反应条件和体系优化,测定特异性、敏感性和稳定性,建立山羊伪结核病Taq Man荧光定量PCR检测方法,并对54份临床样品进行检测。结果显示：建立的山羊伪结核棒状杆菌方法具有很好的特异性,在20μL扩增体系中,引物浓度为0.20μmol/m L,探针浓度为0.45μmol/m L,退火温度59℃时最佳;最低可检测出4.6×102个拷贝数的细菌DNA,标准曲线相关系数是0.996。同时,对Taq Man荧光定量PCR和常规PCR进行了比较,前者的敏感性是后者的1 000倍;对54份临床样品进行检测,Taq Man荧光定量PCR检出的阳性率为68.5%（37/54）,常规PCR检出的阳性率为53.7%（29/54）。研究表明：Taq Man荧光定量PCR法检出率较高,有特异、敏感且快速的特点,适用于临床样品的检测。