萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达

作     者：刘柱 胡新文 朱建清 杨志荣 LIU Zhu 1,HU Xin wen 2,ZHU Jian qing 1,YANG Zhi rong 1 (1 College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610064,China;2,National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 57110

作者机构：四川大学生命科学学院四川成都610064 中国热带农科院热带作物生物技术国家重点实验室海南海口571101 

出 版 物：《西南农业学报》 (Southwest China Journal of Agricultural Sciences)

年 卷 期：2002年第15卷第3期

页      面：85-89页

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 100705[医学-微生物与生化药学] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目 (3 9960 0 65 ) 

主　　题：大肠杆菌 密码偏爱性 PCR定点突变 萝卜抗真菌蛋白 Rs-AFP2 基因表达 

摘      要：根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs AFP2 基因序列 ,结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性 ,人工合成引物 ,利用PCR重叠延伸法 ,使编码序列区的部分核苷酸突变 ,采用嵌套PCR ,迅速克隆到目的基因片段Rs AFPm ,连接到 pGEM Teasy载体上 ,转化大肠杆菌XL1菌株 ,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明 ,PCR产物全长 2 40bp ,有一个阅读框 ,编码 2 9个氨基酸的信号肽和 5 1个氨基酸的抗真菌蛋白 ,与突变前的Rs AFP2 基因相比 ,在编码区第 3号氨基酸Lys相差一个碱基 (TTG→TTA) ,第 5号氨基酸Gln相差一个碱基 (CAG→CAA) ,第 6号稀有密码Arg相差两个碱基 (CAG→CGA) ,但二者编码产生相同。重新合成引物 ,将切除信号肽的Rs AFP2 基因和Rs AFPm基因分别克隆到pET 2 1b(+ )质粒载体上 ,导入大肠杆菌BL2 1菌株。Tricine SDS PAGE电泳显示工程菌中存在 6KD左右的目的蛋白带 ;软件分析显示 ,突变后pETAFPm的表达产物约为突变前 pETAFPo表达产物的2倍 ;抑菌结果表明 ,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于 pETAFP2 表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs AFPm基因与Rs AFP2 基因相比 ,已有效的提高表达量。