强力霉素诱导型Cas9基因编辑小鼠胚胎干细胞系的构建

作     者：姚玉琛 朱少华 曹佳妮 张琳 杨月伟 赵同标 YAO Yu-chen;ZHU Shao-hua;CAO Jia-ni;ZHANG Lin;YANG Yue-wei;ZHAO Tong-biao

作者机构：曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273165 中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室北京100101 

出 版 物：《发育医学电子杂志》 (Journal of Developmental Medicine (Electronic Version))

年 卷 期：2018年第6卷第3期

页      面：160-165页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金国际(地区)合作研究与交流项目-重点国际(地区)合作研究项目(31720103907) 科技部重点研发计划(2018YFA0108402) 中国科学院A类战略性先导科技专项(XDA16030302) 

主　　题：CRISPR/Cas9 四环素诱导 条件性敲除 小鼠ES细胞系 

摘      要：目的建立强力霉素(doxmycin,Dox)诱导型Cas9基因编辑小鼠胚胎干细胞系,以满足不同条件下基因编辑的实验需求。方法根据四环素(tetracycline,Tet)-on诱导表达调控系统的原理,分别构建含有调控元件反义Tet转录激活因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator,rt TA)的表达质粒p CDH-CAG-rt TA-IRES-m Cherry和含有Tet应答元件(Tet-responsive element,TRE)及Cas9的表达质粒p Tight-Cas9-IRES-GFP-Tight-Puro,其中红色荧光蛋白m Cherry通过内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)与rt TA表达,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)通过IRES与Cas9相连,分别指示rt TA与Cas9的表达,Puro抗性基因作为药物筛选标记。将上述两种质粒包装为慢病毒,分步转入小鼠胚胎干细胞中,建立Dox诱导Cas9表达的小鼠胚胎干细胞系。结果首先通过瞬时转染方法在293T细胞中验证其可诱导性,然后结合报告荧光与药物筛选获得同时整合有调控元件rt TA与应答元件TRE及Cas9的小鼠胚胎干细胞系,该细胞系加入Dox后出现有GFP报告荧光表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,rt-q PCR)结果同时表明Cas9可以被成功诱导表达。结论本研究成功构建了Dox诱导Cas9表达的小鼠胚胎干细胞系,该细胞系在基因编辑方法上更加灵活可控,具有很高的潜在应用价值。