时空调控miR-195敲减转基因载体的构建及验证
Construction and identification of miR-195 silencing transgenic vector with temporal and spatial regulation作者机构：哈尔滨医科大学药学院药理教研室 黑龙江中医药大学基础医学院解剖与组胚教研室 哈尔滨市第一医院药剂科
出 版 物：《国际遗传学杂志》 (International Journal of Genetics)
年 卷 期：2016年第39卷第3期
页 面：123-132页
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种]
基 金：黑龙江省教育厅科学技术研究项目面上项目(12531252)~~
主 题：miR-195 转基因载体 Tet-on四环素诱导表达系统
摘 要：目的构建时空调控miR-195敲减转基因载体并验证其活性。方法通过分子克隆技术构建含有神经特异性启动子、四环素诱导表达系统、miR-195海绵、绿色荧光蛋白及绝缘子等调控元件的转基因载体并测序鉴定,利用细胞转染技术将该载体瞬时转染入SHSY5Y细胞,经荧光显微镜观察其荧光表达,利用实时定量PCR技术及蛋白免疫印迹检测miR-195含量及GFP蛋白表达。结果通过将Tet-on四环素诱导系统中反义转录激活子rtTA克隆到NSE启动子下游,以及TRE-Tight的多克隆位点内引入miR-195海绵携带IRES介导的EGFP,获得双质粒Tet-on表达载体。以pcDNA3.1+质粒为骨架,3个不同区域的双拷贝cHs4绝缘子核心片段为间隔,将其调控元件(NSE-rtTA)和反应元件(TRE-miR-195 spongeIRES-EGFP)串联成单一转基因载体。该载体经测序验证序列正确,瞬时转染入SH-SY5Y细胞,经强力霉素诱导36 h后细胞内可见明显绿色荧光蛋白表达,且miR-195表达水平明显降低。结论成功构建神经系统特异性miR-195敲减转基因载体,并具有时空调控的特点,为进一步建立转基因动物模型奠定基础。
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