hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定

作     者：黄向辉 时志斌 王坤正 党晓谦 杨佩 余鹏博 HUANG Xianghui;SHI Zhibin;WANG Kunzhen;DANG Xiaoqian;YANG Pei;YU Pengbo

作者机构：西安交通大学第二附属医院骨一科西安710004 陕西省疾病预防控制中心病毒室 

出 版 物：《中国修复重建外科杂志》 (Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery)

年 卷 期：2008年第22卷第7期

页      面：807-813页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(30600624)~~ 

主　　题：腺相关病毒载体 VEGF BMP 内部核糖体进入位点序列 

摘      要：目的通过引入内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES),构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体(adeno-associated virus,AAV),并对其进行鉴定。方法以AAV腺相关病毒包装系统(helper-free system)为基础,将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中,形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因,先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点,获得重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,同时包装含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的重组病毒rAAV-IRES-GFP作平行对照。荧光显微镜下监测病毒包装效率,收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7经双酶切鉴定正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72h后,病毒包装效率达95%～100%,收获的重组病毒具有较高浓度及活性,感染AAV-HT1080效率达90%,荧光计数法测定病毒感染滴度达5.5×1011vp/mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因hVEGF165及hBMP-7片段,重组病毒包装成功。结论成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF165及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础。