E2F3基因腺相关病毒干扰载体的构建

作     者：胡海龙 韩瑞发 孙岩 刘利维 任海林 梁恩利 王春阳 吴长利 

作者机构：天津市泌尿外科研究所天津市300211 

出 版 物：《中国肿瘤临床》 (Chinese Journal of Clinical Oncology)

年 卷 期：2009年第36卷第19期

页      面：1117-1119页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(编号:30700834) 天津市科技计划项目(编号:07ZCGYSF05200) 天津市高等学校科技发展基金计划项目(编号:20060122) 天津市卫生局科技基金资助(编号:05KYZ60)~~ 

主　　题：AAV系统 RNAi E2F3 

摘      要：目的:构建针对E2F3基因的腺相关病毒干扰穿梭质粒载体,为进一步包装能够表达干扰序列的病毒奠定基础。方法:通过已经合成的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo干扰质粒载体,进行限制性内切酶Mlu酶切,将干扰片段克隆入线性质粒pAAV-MCS中,构建具有表达沉默E2F3基因的RNA干扰穿梭质粒。通过Bgl Ⅱ及Mlu单酶切,BamH1和HandⅢ双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建是否成功。结果:pAAV-siE2F3线性化后,片段大小约6 300bp;以Mlu为两边酶切位点设计的引物对重组质粒进行PCR,可获得的产物大小1 700bp;应用ITR专用引物进行重组质粒的PCR后证实本研究所构建的重组质粒ITR片段存在,大小约3 500bp,上述指标均与预期设计结果相符。基因测序结果表明插入序列无基因突变,序列完整。结论:穿梭质粒载体的成功构建,为进一步包装能够表达针对E2F3基因干扰序列的腺相关病毒,进一步研究E2F3基因在肿瘤中的功能奠定基础。