MiR-145调节G蛋白偶联受体98抑制结直肠癌细胞的奥沙利铂耐药性

作     者：付强 成静 张金岱 张永磊 陈小兵 谢建国 罗素霞 Fu Qiang;Cheng Jing;Zhang Jindai;Zhang Yonglei;Chen Xiaobing;Xie Jianguo;Luo Suxia

作者机构：河南省肿瘤医院(郑州大学附属肿瘤医院)胃肠外科中心450008 河南省肿瘤医院(郑州大学附属肿瘤医院)消化肿瘤内科450008 郑州市中心医院(郑州大学附属郑州中心医院)肿瘤内科450002 

出 版 物：《中华胃肠外科杂志》 (Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery)

年 卷 期：2017年第20卷第5期

页      面：566-573页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：河南省科技厅科技创新人才计划（201301014） 

主　　题：结直肠肿瘤 G蛋白偶联受体98 MiR-145 HCT116细胞株:奥沙利铂 

摘      要：目的预测鉴定miR-145靶基因，探讨miR-145抑制结直肠癌细胞株HCT116奥沙利铂（L-OHP）耐药性的机制。方法在人结直肠癌细胞株HCT116的基础上，建立人结直肠癌L-OHP耐药细胞株HCT116/L-OHP。脂质体转染法将miR-145的模拟体miRNA-mimics及阴性对照NC-miRNA转染入HCT116/L-OHP，得到过表达miR-145的细胞株HCT116/L-OHPmimics及其阴性对照HCT116/L-OHPNC。预测miR-145的靶基因并用荧光素酶方法验证。确定靶基因为G蛋白偶联受体98（GPR98）后，构建质粒并转染细胞，得到过表达GPR98的HCT116/L-OHPGPR98细胞及其对照HCT116/L-OHPcontrol；同时通过更改GPR98 cDNA中与miR-145结合的序列，得到同时过表达GPR98和miR-145的HCT116/L-OHPmimics＋GPR98细胞。本研究采用CCK-8法检测细胞的增殖能力[吸光值（A）]值和对L-OHP的敏感性（被测拮抗剂的半抑制浓度IC50越低，代表对药物的敏感性越强）。实时定量PCR检测miR-145和GPR98的mRNA表达水平；western blot法检测GPR98和耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药蛋白1（MRP1）以及抑癌基因PTEN的蛋白表达水平。结果成功建立耐药细胞株HCT116/L-OHP[IC50：（42.34 ± 1.05）μg/ml，高于HCT116细胞的（9.81 ± 0.95）μg/ml，t= 39.784，P= 0.000；miR-145：0.27±0.04，低于HCT116细胞的1.00 ± 0.09，t= 13.021，P= 0.000]。在HCT116/L-OHP基础上，成功构建HCT116/L-OHPmimics细胞[miR-145：10.01 ± 1.05，高于HCT116/L-OHPNC（1.06 ± 0.14）和HCT116/L-OHP（1.00 ± 0.16），F= 161.797，P= 0.000]。GPR98经鉴定是miR-145的靶基因。HCT116/L-OHPGPR98细胞中GPR98的mRNA和蛋白相对表达分别为8.48 ± 0.46和1.71 ± 0.09，与HCT116/L-OHPcontrol（mRNA：3.65 ± 0.40；蛋白：1.21 ± 0.10）和HCT116/L-OHP（mRNA：3.49 ± 0.35；蛋白：1.22 ± 0.08）比较，差异有统计学意义（均P 〈 0.05）。HCT116/L-OHPGPR98细胞A450值为1.31 ± 0.10，高于HCT116/L-OHP（0.82±0.08，t=6.251，P=0.000）；HCT116/L-OHPmimics＋GPR98细胞A450值为0.89 ± 0.08，高于HCT116/L-OHPmimics（0.20 ± 0.05，t= 11.158，P= 0.000）。HCT116/L-OHPGPR98细胞中耐药蛋白P-gp和MRP1的相对表达水平分别为1.53 ± 0.18和1.49 ± 0.20，高于HCT116/L-OHP细胞（分别为1.00 ± 0.06和1.21 ± 0.13），而抑癌蛋白PTEN的相对表达水平为0.12 ± 0.03，低于HCT116/L-OHP细胞（1.25 ± 0.14），差异均有统计学意义（均P 〈 0.05）。HCT116/L-OHPmimics＋GPR98细胞P-gp和MRP1的蛋白相对表达水平分别为1.02 ± 0.24和1.38 ± 0.25，高于HCT116/L-OHPmimics（分别为0.20 ± 0.07和0.55 ± 0.10），而PTEN的蛋白相对表达水平为1.41 ± 0.16，低于HCT116/L-OHPmimics（1.98 ± 0.13），差异均有统计学意义（均P 〈 0.05）。HCT116/L-OHPGPR98 IC50为（73.54 ± 1.21）μg/ml，高于HCT116/L-OHP的（41.25 ± 1.56）μg/ml（t= 25.041，P= 0.000）；HCT116/L-OHPmimics＋GPR98 IC50为（48.80 ± 1.75）μg/ml，高于HCT116/L-OHPmimics的（19.20 ± 0.81）μg/ml（t= 22.994，P= 0.000）。结论miR-145通过抑制靶基因GPR98的表达水平，从而抑制人结直肠癌细胞株HCT116细胞的L-OHP耐药性。