TMEM33 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及功能验证

作     者：冯胜娟 吕晓武 刘真 李文婷 吴玉家 张亚洁 王瑞晨 曺令 邱亚斌 贾赤宇 Feng Shengj uan;Lü Xiaowu;Liu Zhen;Li Wenting;Wu Yuj ia;Zhang Yaj ie;Wang Ruichen;Cao ling;Qiu Yabin;Jia Chiyu

作者机构：解放军第三○九医院烧伤整形科北京100091 

出 版 物：《感染．炎症．修复》 (Infection Inflammation Repair)

年 卷 期：2014年第15卷第4期

页      面：204-208页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金面上资助项目(81372051) 北京市自然科学基金资助项目(7122179) 北京市自然科学基金资助项目(7123229) 总参军事医学和老年病科研基金项目(ZCWS14B06) 解放军第三○九医院院管课题(2014MS-001) 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB518104) 全军医学科技"十二五"重点课题(BWS11C061) 中国博士后科学基金面上资助二等资助(2012M512081 2012M521846) 

主　　题：TMEM33 荧光素酶报告基因 微小RNA-146a 肺损伤,吸入性 

摘      要：目的:根据microRNA-146a(miR-146a)预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒并进行功能验证,为研究吸入性损伤中miR-146a通过靶向跨膜蛋白33(TMEM33)对Toll样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路的调控作用提供前期的工作基础。方法:通过生物学软件预测TMEM33mRNA 3′端非翻译区(TMEM33mRNA 3′-UTR)可能是miR-146a的作用靶点,将设计合成的TMEM33及其突变序列TMEM33-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒,采用脂质体法将这两种重组荧光素酶报告质粒pMIR-TMEM33和pMIR-TMEM33-mu分别与miR146amimics共转染HEK-293T细胞,以pMIR-TMEM33+miR-control转染HEK-293细胞作对照,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:TargetScan和miRanda软件预测显示,miR-146a与TMEM33mRNA 3′-UTR存在互补结合位点,构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统显示,miR-146a对TMEM33mRNA 3′-UTR具有靶向作用,pMIR-TMEM33+miR146amimics组较pMIR-TMEM33+miR-control组荧光素酶活性降低62%左右,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:成功构建TMEM33mRNA 3′-UTR荧光素酶报告载体,证实miR-146a对TMEM33mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为从基因水平深入揭示吸入性肺损伤发病机制提供实验室数据和方法。