病原迟钝爱德华菌毒力基因及双重PCR与LAMP检测方法的建立

作     者：张晓君 白雪松 毕可然 阎斌伦 秦蕾 陈丽 徐静 

作者机构：淮海工学院海洋学院江苏省海洋生物技术重点实验室江苏省海洋资源开发研究院 

出 版 物：《水产学报》 (Journal of Fisheries of China)

年 卷 期：2013年第37卷第7期

页      面：1087-1094页

核心收录：

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

基　　金：江苏省水产三项工程项目(PJ2010-58,DY2012-3-7) 中央财政支持地方高校发展专项(CXTD16) 连云港市科技攻关项目(CG1134) 江苏高校优势学科建设工程项目(2011) 

主　　题：迟钝爱德华菌 毒力基因 双重PCR 环介导恒温扩增技术(LAMP) 

摘      要：为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和171 bp两条目的条带,且灵敏度为3.0×103CFU/mL,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA设计的4条特异引物进行的LAMP扩增,病原迟钝爱德华菌可扩增出阶梯状条带,反应产物加入荧光染料SYBR GreenⅠ后反应液呈现明显的绿色阳性反应,4株对照菌无阶梯状扩增条带且呈现橙色阴性反应,灵敏度为3.0×101CFU/mL,比双重PCR的检测限要低100倍。研究表明,操作简便、快速且特异性及灵敏性强的LAMP检测方法,对迟钝爱德华菌引起的水产动物疾病的快速诊断具有实践意义。