焦磷酸测序技术在确证贾第鞭毛虫和隐孢子虫中的应用

作     者：孙涛 邓明俊 季新成 肖西志 徐彪 凌宗帅 岳志芹 王群 郑小龙 

作者机构：山东出入境检验检疫局青岛266002 新疆出入境检验检疫局乌鲁木齐830063 济南出入境检验检疫局济南250014 

出 版 物：《中国人兽共患病学报》 (Chinese Journal of Zoonoses)

年 卷 期：2013年第29卷第10期

页      面：1021-1025,1035页

核心收录：

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：科技部质检公益项目(201110039)资助~~ 

主　　题：贾第鞭毛虫 隐孢子虫 序列比对 焦磷酸测序 

摘      要：目的本研究旨在通过对贾第鞭毛虫和隐孢子虫(简称两虫)进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术建立一种快速、简单地确证两虫的方法。方法通过序列信息比对,对贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,tim)基因和隐孢子虫18SrRNA基因的保守区段设计扩增引物及测序引物。用Sheather’s蔗糖密度离心法从粪便标本中分离纯化贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊。酚-氯仿法抽提孢囊、卵囊总DNA,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing Technology,PSQ)针对两虫基因保守核苷酸区段进行测序分析。同时利用扩增引物与其他原虫进行特异性试验,利用测序引物进行重复性试验。结果通过序列信息比对寻找到了表征贾第鞭毛虫tim基因和隐孢子虫18S rRNA基因的核苷酸保守区段,经焦磷酸测序后能进一步确证虫株的序列信息,同时与Sanger法测序结果比对显示一致。特异性试验表明,不与其它原虫发生交叉反应;重复性试验表明,重现性为100%。结论基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证两虫的方法使用。