土壤细菌新Mn(II)氧化蛋白PomA的异源表达及其酶学特性

作     者：郭岳帅 曹董恒 陈莎 薛岚 李丁 

作者机构：湖南工业大学生命科学与化学学院 百合种质资源创新与深加工湖南省工程研究中心 株洲市环境微生物与植物资源利用联合实验室 

出 版 物：《微生物学通报》 (Microbiology China)

年 卷 期：2025年

核心收录：

学科分类：07[理学] 0713[理学-生态学] 

基　　金：国家自然科学基金(32171622,51774129) 湖南省科技创新计划(2022RC1128) 

主　　题：土壤细菌 Mn(II)氧化蛋白 异源表达 酶学特性 

摘      要：【背景】锰元素在生物地球化学循环中扮演着重要角色，在自然界主要以锰氧化物形式存在。细菌介导的Mn（II）氧化作用是地表锰氧化物形成的重要因素。当前关于细菌Mn（II）氧化蛋白研究多集中于水生细菌，而土壤细菌Mn（II）氧化蛋白研究有待加强。【目的】以土壤Mn（II）氧化细菌普罗威登斯属锰氧化细菌（Providencia manganoxydans）LLDRA6为对象，克隆鉴定出新的Mn（II）氧化蛋白。【方法】提取菌株LLDRA6总DNA，设计引物克隆目的基因pomA，利用大肠杆菌表达菌株BL21和表达载体pET32a（+）对其进行异源表达，超声破碎获得粗酶液，使用Ni-NTA琼脂糖蛋白纯化树脂纯化目的蛋白PomA，研究该蛋白体外Mn（II）氧化活性及酶学特性。【结果】成功构建了表达菌株BL21-pET-pomA，分离纯化出PomA蛋白，其分子量大小为59.4 kDa。序列分析表明，PomA具有4个保守的铜离子结合位点，属于多铜氧化酶。液体LB培养基培养发现，BL21-pET-pomA的Mn（II）氧化能力是BL21-pET的3.6倍。体外实验表明，PomA同时具有Mn（II）氧化活性和漆酶活性。其中，PomA的Mn（II）氧化最适反应温度为60℃，最适反应pH为7.8，酶学参数Km为3.11±0.02 mmol/L，Vmax为3.931×10-6mol/（L·min），kcat为2.38 min-1。PomA的漆酶活性最适反应温度为60℃，最适反应pH为3.0，Km为47.29±0.02 μmol/L，Vmax为3.401×10-6mol/（L·min），kcat为0.23 s-1。【结论】PomA属于多铜氧化酶，同时具有Mn（II）氧化活性和漆酶活性。由于其氨基酸序列与其它Mn（II）氧化多铜氧化酶存在较大差异，可能导致它们在催化活性上存在差异。