鸡chNHE1精准基因编辑细胞系的构建及其抗ALV-J感染的研究

作     者：张学富 陈运通 范文瑞 张子博 于蒙蒙 王素艳 祁小乐 李留安 高玉龙 ZHANG Xuefu;CHEN Yuntong;FAN Wenrui;ZHANG Zibo;YU Mengmeng;WANG Suyan;QI Xiaole;LI Liuan;GAO Yulong

作者机构：天津农学院动物科学与动物医学学院天津300384 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队哈尔滨150069 

出 版 物：《畜牧兽医学报》 (ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA)

年 卷 期：2024年第55卷第11期

页      面：5238-5246页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 090601[农学-基础兽医学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金(32230105) 国家肉鸡产业技术体系(CARS-41) 国家农业重大科技项目(NK2022100103) 

主　　题：DF-1 chNHE1 ALV-J 基因编辑 

摘      要：旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系,PCR及测序分析结果显示,其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换,基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平,对传至第25代的细胞系进行测序分析,结果显示,chNHE1基因未发生回复性突变;进一步细胞计数分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响;为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力,分别利用ALV-J荧光报告病毒(ALV-J-GFP)及ALV-J原型毒株(HPRS-103)对其进行病毒感染试验,荧光观察结果及流式细胞分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染;进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选,成功构建了chNHE1基因编辑细胞系,其可完全抵抗ALV-J的感染,且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好,为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。