FLT3基因3′-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

作     者：高晓宁 林季 李永辉 王莉莉 于力 GAO Xiao-Ning;LIN Ji;LI Yong-Hui;WANG Li-Li;YU Li

作者机构：解放军总医院血液科北京100853 解放军总医院基础医学所生化室北京100853 

出 版 物：《中国实验血液学杂志》 (Journal of Experimental Hematology)

年 卷 期：2010年第18卷第3期

页      面：694-697页

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金面上项目 编号30670898 30971297 国家重点基础研究发展计划(973)资助项目 编号2005CB522400 

主　　题：FLT3基因 microRNA 3’-非翻译区 荧光素酶报告载体 基因调控 基因转染 

摘      要：为分析FMS样酪氨酸激酶3(FMS-liketyrosine kinase3,FLT3)基因3′-非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建FLT3基因3′-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用。采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增FLT3基因3′-UTR区序列,插入经PstI和EcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control(pGL3-control-m);通过Target Scan5.1软件预测可能与FLT3基因3′-UTR作用的miRNA;采用FuGENEHD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了含有804bp的FLT3基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,FLT3基因3′-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20%左右。结论:成功构建了FLT3基因3′-UTR-荧光素酶报告载体,而miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性。