重组慢病毒载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的研究

作     者：刘思征 赖秀蓝 陈元国 贺谷雨 Martín Maldonado 林丽敏 谢丽春 吴卫照 黄天华 蔡志伟 刘必刚 马廉 

作者机构：汕头大学医学院第二附属医院儿科广东515041 汕头大学医学院第二附属医院转化医学中心广东515041 

出 版 物：《中国小儿血液与肿瘤杂志》 (Journal of China Pediatric Blood and Cancer)

年 卷 期：2014年第19卷第1期

页      面：14-20页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81070478) 

主　　题：重组慢病毒载体 基因转染 人脐带间充质干细胞 绿色荧光蛋白 浓度梯度稀释法 细胞重编程 

摘      要：目的 利用包装制备的重组慢病毒载体感染人脐带间充质干细胞,为后续的细胞重编程奠定基础.方法 利用组织块贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞（HUMSC）.携带目的基因（oct4、sox2、klf4、c-myc）及绿色荧光蛋白的质粒经验证、扩增后,转染HEK-293T细胞,制备携带上述基因的慢病毒上清液.荧光显微镜下梯度稀释法检测病毒滴度.慢病毒液感染3～5代生长良好的HUMSC,荧光显微镜及流式细胞术检测病毒感染力,RT-PCR及定量PCR检测目的基因mRNA水平.结果 成功验证、扩增携带目的基因的质粒.制备的新鲜病毒液滴度达5×108U/mL,冻存后降为5×106 U/ml.重组慢病毒感染HUMSC的感染力高于80％,4种目的基因的表达均明显高于对照.结论 重组慢病毒载体可以在体外高效的转染HUMSC,并稳定表达目的基因,是HUMSC重编程的有效基因转移载体.