基于计算设计的GH11家族木聚糖酶CDBFV的热稳定性改造及潜在机制研究

作     者：韩雪 张阿娜 王海燕 辛凤姣 谷天一 王钰璐 

作者机构：中国农业科学院农产品加工研究所 中国农业科学院农产品加工与营养健康研究院(沧州) 山西农业大学食品学院 北京挑战生物技术有限公司 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2024年

核心收录：

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

基　　金：企业合作项目(饲用酶产品开发与升级) 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(S2022JBKY-13) 中国农业科学院农产品加工研究所创新工程院所重点任务(CAAS-ASTIP-G2022-IFST-07) 

主　　题：木聚糖酶 柔性区域 热稳定性 毕赤酵母 理性设计 

摘      要：【目的】瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum GH11家族木聚糖酶CDBFV在饲料、食品等领域具有良好应用前景，提高其热稳定性对其生产应用十分重要。【方法】使用分子动力学模拟、机器学习等策略设计潜在CDBFV热稳定性突变体，在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达纯化，测定最适反应条件、比酶活和85℃孵育3 min后相对剩余活力，通过结构分析明确热稳定性提高机制。【结果】位于CDBFV N端基序36GNNS39具有较高柔性，对其改造设计的单突变体N37P和N38V在85℃孵育3 min后，相对活力分别降低至70.3%和55.1%，较野生型（48.7%）提升了21.6%和6.5%；进而，在相对活力提升显著的N37P基础上叠加已报道优势突变体N88G，构建双突变体N37P/N88G，其相对活力达到了73.4%，较野生型提高了24.7%；此外，将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达，在85℃处理3 min后，相对活力达到了88.8%；结构分析表明，N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的氢键相互作用，降低活性位点附近柔性，并干预了糖基化形成，进而提高了热稳定性。【结论】成功得到了高耐热双突变体N37P/N88G，为提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造提供了新的思路和方法，有望推动CDBFV在饲料工业等高温环境下的广泛应用。