pH指示剂法检测火龙果糖转运蛋白HpSWEET1a和HpSWEET4a的转运活性

作     者：郑乾明 王小柯 王红林 周嘉 解璞 马玉华 

作者机构：贵州省农业科学院果树科学研究所农业农村部喀斯特山区作物基因资源与种质创新重点实验室 

出 版 物：《园艺学报》 (Acta Horticulturae Sinica)

年 卷 期：2024年第9期

页      面：2195-2206页

核心收录：

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

基　　金：国家自然科学基金项目(32060674) 贵州省高层次创新型人才项目(黔科合平台人才-GCC025-1) 贵州省科研机构创新能力建设专项(黔科合服企8) 

主　　题：火龙果 糖转运蛋白 pH指示剂 酵母表达 比色法 

摘      要：针对酵母生长互补方法的缺点，利用pH指示剂指示酵母胞外酸化，建立一种检测候选SWEET(sugars will eventually be exported transporter)基因转运活性的新方法。使用0.006%溴甲酚紫（BCP）作为pH指示剂，获得不同pH值下波长589 nm和432 nm的光吸收值A589和A432，建立pH值与A589/A432比值（R589/432）的相关性函数方程。从火龙果（Hylocereus polyrhizus）果实中分离HpSWEET1a和HpSWEET4a基因，两者编码蛋白序列与拟南芥AtSWEET1和AtSWEET4分别具有66.67%和55.36%的一致性，分别属于SWEETⅠ和Ⅱ类成员。利用酵母糖吸收缺陷株系***4000表达HpSWEET1a和HpSWEET4a基因，糖饥饿处理后添加葡萄糖或果糖，HpSWEET1a、HpSWEET4a和AtSWEET1(At1g21460，阳性对照)均促使酵母胞外BCP颜色在3～16h由紫色变为黄色，说明发生明显的胞外酸化。进一步的试验表明HpSWEET1a、HpSWEET4a和AtSWEET1促进酵母胞外pH值在3～16 h下降约1.00，载体对照仅下降约0.10。酵母胞外酸化和pH值的明显下降，证明了HpSWEET1a、HpSWEET4a与AtSWEET1功能类似，均具有葡萄糖和果糖转运活性。使用基于超微量分光光度的比色法检测R589/432值，进一步简化检测步骤和缩短时间。添加葡萄糖后培养0.5 h,HpSWEET1a的R589/432值的下降水平远大于载体对照，证明该方法有效。本研究中建立的方法从耗时、准确性、操作和通量等方面均优于目前常用的酵母生长互补检测，可广泛应用于定位细胞膜的SWEET转运蛋白研究。