牛肠道病毒Syber Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

作     者：尹柳祎 王建龙 郭宇 张璇 郭帅 吕香玉 宋扬 翟景波 温树波 YIN Liuyi;WANG Jianlong;GUO Yu;ZHANG Xuan;GUO Shuai;LV Xiangyu;SONG Yang;ZHAI Jingbo;WEN Shubo

作者机构：内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000 内蒙古自治区动物疫病预防控制中心 内蒙古通辽市动物疫病预防控制中心 内蒙古自治区布鲁氏菌病防治工程技术研究中心 

出 版 物：《中国病原生物学杂志》 (Journal of Pathogen Biology)

年 卷 期：2024年第19卷第10期

页      面：1177-1181页

核心收录：

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：内蒙古自治区青年科技英才项目(No.NJYT22053,NJYT23095) 2024中央支持地方高校科研平台项目一人兽共患病防控自治区高等学校重点实验室项目 自治区直属高校基本科研业务费(No.GXKY22096) 内蒙古自治区博士启动基金项目(No.KYQD18072,KYQD19079) 

主　　题：牛肠道病毒 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 特异性 

摘      要：目的 建立一种简便快速、特异性和重复性好、灵敏度高的牛肠道病毒(Bovine Enterovirus, BEV)检测方法。方法 根据GenBank公布的BEV基因序列,选取保守区核苷酸序列,利用Pirmer 5.0设计引物,通过PCR扩增目的基因片段,将其连接到pMD18-T载体上构建重组标准品质粒pMD18-T-BEV。构建荧光定量PCR方法,利用软件Quant Studios Design&Analysis Software自动生成标准曲线及溶解曲线。检测其重复性、特异性和灵敏度并与传统PCR方法比较。结果 建立的荧光定量检测方法标准曲线在3.2×10^(1)~3.2×10^(9)拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.997,斜率为-3.387;组间变异系数3.16%,组内变异系数1.67%;与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛库布病毒(BKOV)、牛环曲病毒(BTOV)、牛诺如病毒(BNOV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)的cDNA样品无交叉反应;最低检测限度为3.2×10^(1)拷贝/μL,是常规PCR检测灵敏度的1 000倍。利用本研究建立的荧光定量检测方法对采集自内蒙古自治区9个盟市的86份牛腹泻样品进行检测,其阳性率为26.74%,远高于传统PCR检测出的阳性率4.56%。结论 本研究成功建立了一种BEV SYBR GreenⅠReal-time PCR方法,该方法具有较高的灵敏度、特异性和可重复性,适用于规模化养殖场牛肠病毒的快速检测。为内蒙古自治区BEV的检测和流行病学调查提供依据。