大肠杆菌焦磷酸酶的表达及其酶学性质研究

作     者：王赞丞 王璐 樊俊萍 陈雨点 陈婷婷 刘露露 李勇昊 WANG Zancheng;WANG Lu;FAN Junping;CHEN Yudian;CHEN Tingting;LIU Lulu;LI Yonghao

作者机构：重庆科技大学化学化工学院重庆401331 

出 版 物：《中国酿造》 (China Brewing)

年 卷 期：2024年第43卷第9期

页      面：65-71页

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金项目(22378033) 重庆市自然科学基金项目(CSTB2022NSCQ-MSX0544) 重庆市教委科学技术研究项目(KJQN202301546) 重庆科技大学研究生科研创新项目(YKJCX2320503) 

主　　题：焦磷酸酶 大肠杆菌 诱导表达 酶学性质 

摘      要：该研究通过聚合酶链式反应(PCR)扩增克隆大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)的焦磷酸酶(PPase)基因,采用无缝克隆技术构建焦磷酸酶表达载体pET-28a-ppa,并转化至感受态***(DE3),构建重组菌株*** PPa.采用单因素试验对其诱导表达条件进行优化,并进一步采用镍离子磁珠纯化重组PPas,研究其酶学性质。结果表明,成功构建重组菌株***,当异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导温度和诱导时间分别为0.4 mmolL、20℃和8h时,重组PPase活性达到最高,为129.05 IU/mL,是优化前的3.14倍。重组PPase的理论分子质量为19.7kDa;最适反应温度和pH分别为55℃和9,在温度10~30℃及pH 7.0~9.0范围内稳定;金属离子K^(+)、Mg^(2+)和Na^(+)可极显著性提高该酶活性(P0.01),而Mn^(2+)和Zn^(2+)对该酶有极显著抑制作用(P0.01);重组PPase的动力学参数米氏常数(K_(m)值)为3.58 μmol/mL、最大反应速率(V_(max)值)为314.66μmol/(mL·min),催化常数(K_(cat)值)为87300.56S^(-1),半失活时间为10 min。该研究为后续工业化生产PPase及对该酶的理性设计提供依据。